Метаболическая организация окислительных путей у дрожжей Yarrowia lipolytica – продуцентов органических кислот (31.08.2009)

Автор: Моргунов Игорь Григорьевич

Y. lipolytica 667 +++ 516 2,7 Y. lipolytica 710 ++++ 840 5,3

Y. lipolytica 668 +++ 798 4,0 Y. lipolytica 711 +++ 600 5,1

Y. lipolytica 672 ++++ 120 н.о. Y. lipolytica 716 +++ 810 4,4

Y. lipolytica 674 ++++ 1680 3,2

Метод А – Липолитическую активность оценивали по зонам помутнения среды, связанным с появлением нерастворимых кальциевых солей жирных кислот, образуемых в ходе гидролиза жира. Метод Б – Активность липазы (Ед./мл) определяли титрометрическим методом у дрожжей при культивировании в жидкой среде Ридер с рапсовым маслом (20 г/л) в качестве источника углерода и энергии.

Метод очистки липазы состоит из трех стадий. Внеклеточная липаза из Y. lipolytica 704, при культивировании в среде с подсолнечным маслом была очищена за три стадии (табл. 6). На первой стадии в связи с отсутствием фермента в фильтрате культуральной жидкости клетки подвергали солюбилизации 0,2%-ным раствором Triton X-100 или обрабатывали ультразвуком.

На следующей стадии экстракт фракционировали сульфатом аммония (80% от насыщения). Полученный после высаливания осадок растворяли в 50 мМ калий-фосфатном буфере (pH=7,5) и наносили на колонку с фенил-сефарозой. Элюцию липазы проводили в градиете сульфата аммония (1 – 0 М). Фракции, содержащие активность фермента, объединяли и концентрировали на

Таблица 6. Очистка липазы из Y. lipolytica

Стадия очистки

Общий белок (мг)

Общая активность (Ед) Активность

(мкмоль/

мин мг белка)

Степень очистки

Грубый экстракт + УЗ 25,0 4580,0 183,20 100 1

Осаждение (NH4)2SO4 6,6 1634,61 247,67 35,69 3,79

Фенил-сефароза 1,5 2025,0 1350,00 44,21 16,7

диализной ячейке. В результате внеклеточная липаза была очищена более чем в 16,7 раз с выходом 44,21 % и имела удельную активность 1350 ?моль/мин мг белка. Очищенная липаза была гомогенна при ультрацентрифугировании и электрофорезе.

Свойства липазы. Липаза из Y. lipolytica имела молекулярную массу порядка 38 кДа. Молекулярная масса липазы других штаммов Y. lipolytica составляет 32-39 кДа (Ota et al. 1982; Pereira-Meireles et al. 1997). Оптимум рН=8,0, стабильность препарата сохраняется в диапазоне рН=6,0-9,0. Фермент выдерживает инкубацию при 500 в течение 10 мин. Активность липазы ингибировалась ионами тяжелых металлов и активировалась ионами Mn2+, Mg2+ и Ca2+.

2. Механизмы сверхсинтеза органических кислот у Y. lipolytica

Биосинтез кетокислот дрожжами Y. lipolytica при росте на глицерине и глюкозе. Определяющим условием сверхсинтеза кетокислот является лимитирование роста дрожжей тиамином при одновременном избыточном содержании в среде источников углерода, азота и других биогенных элементов (Ермакова, 1971; Лозинов, Финогенова, 1972).

17 штаммов дрожжей, относящихся к роду Candida были проверены на образование кетокислот при росте в среде с глицерином или глюкозой. Большинство из исследуемых дрожжей были способны синтезировать пировиноградную кислоту (ПВК) и ?-кетоглутаровую кислоту (КГК) как в среде с глицерином, так и в среде с глюкозой. При этом как абсолютное количество накапливаемых в среде кетокислот, так и их соотношение было различным. Для дальнейших исследований как наиболее активные кислотообразователи выбраны штаммы Y. lipolytica 374/4.

Дрожжи Y. lipolytica выращивали в среде с различными лимитирующими концентрациями тиамина. В качестве источника углерода использовали глюкозу или глицерин (рис. 2). Накопление биомассы на обоих субстратах было пропорционально количеству внесенного в среду тиамина, причем и на глюкозе и на глицерине этот прирост был практически одинаков. Однако при этом наблюдались различия в экскреции кетокислот. В среде с глюкозой при повышении концентрации тиамина в пределах исследуемых концентраций повышался выход КГК, в то время как выход пирувата падал. При концентрациях тиамина в среде 1-2,5 мкг/л накапливалась преимущественно ПВК, а при концентрациях 3-5 мкг/л соотношение менялось в пользу КГК. В среде с глицерином при всех исследованных концентрациях тиамина наблюдался преимущественный синтез ПВК, хотя соотношение пируват/2-оксоглутарат менялось в зависимости от концентрации тиамина.

Биосинтетическая активность Y. lipolytica была проверена в ферментере при концентрации тиамина в среде 8 мкг/л, которая обеспечивает накопление 10 г/л биомассы. Накопление кетокислот начинается в фазе замедленного роста и интенсивно продолжается в стационарной фазе. Как на глицерине, так и на глюкозе наблюдается преимущественный синтез ПВК, и на 78 ч в среде с

Рис. 2. Влияние концентрации тиамина в среде на кислотообразование у Y. lipolytica 374/4.

? - Биомасса, ?- ПВК, ? – КГК

глицерином отмечалось накопление 61,3 г/л ПВК и 10 г/л КГК, а в среде с глюкозой - 41 г/л ПВК и 8 г/л КГК (рис. 3).

Для изучения путей биосинтеза кетокислот были определены активности ферментов начальных этапов метаболизма глицерина и глюкозы, ЦТК и анаплеротических путей. Клетки отбирались в фазу экспоненциального роста (нет кислот), в фазу замедленного роста (начало синтеза кислот) и в стационарную фазу (в период активного синтеза кетокислот) (табл. 7, 8).

Рис. 3. Сверхсинтез кетокислот у Y. lipolytica 374/4 в условиях дефицита тиамина (культивирование в ферментере). ? - Биомасса, ?- ПВК, ? - КГК

Как было отмечено выше, фосфорилирование глицерина до глицерол-3-фосфата с участием глицеролкиназы является единственным путем вовлечения глицерина в метаболизм у Y. lipolytica. Как видно из табл. 7, активность глицеролкиназы не изменяется в фазе замедления роста, когда начинается синтез кетокислот, и остается на высоком уровне в стационарной фазе. Активность НАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы снижается в 2 раза в условиях дефицита тиамина и синтеза кетокислот. В то же время активность ФАД-зависимого фермента возрастает вдвое при замедлении роста культуры, что подтверждает предположение о ключевой роли данного фермента в окислении глицерол-3-фосфата. Активности ключевых ферментов, участвующих в превращении диоксиацетонфосфатата в пируват, – глицеральдегидфосфатдегидрогеназы и пируваткиназы – при дефиците тиамина сохраняются на уровне, близком к таковому в период экспоненциального роста.

Таблица 7. Активность ферментов (?моль/мин мг белка) путей метаболизма глицерина у

Y. lipolytica

ФЕРМЕНТЫ Экспоненциальная

фаза Фаза замедления роста Стационарная фаза

I. Начальные этапы ассимиляции глицерина:

Глицеролкиназа 0,105 0,095 0,130

Глицерол-3Ф-дегидрогеназа (НАД+) 0,052 0,026 0,023

Глицерол-3Ф-дегидрогеназа (ФАД+) 0,041 0,085 0,082

II. Гликолиз

6-фосфофруктокиназа 0,07 0,06 0,05


загрузка...