Метаболическая организация окислительных путей у дрожжей Yarrowia lipolytica – продуцентов органических кислот (31.08.2009)

Автор: Моргунов Игорь Григорьевич

Y. lipolytica функционирует только фосфорилирующий путь метаболизма этого субстрата.

Функционирование глицеролдегидрогеназного пути метаболизма глицерина обнаружено у дрожжей C. valida. В экстрактах этих дрожжей обнаружены глицеролдегидрогеназа и диоксиацетонкиназа, а глицеролкиназа и глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы отсутствовали. Дрожжи C. valida обладают высокой активностью алкогольдегидрогеназы. Поскольку алкогольдегидрогеназа характеризуется широкой субстратной специфичностью, можно было бы предположить, что этот фермент катализирует НАД-зависимое окисление глицерина. Однако это предположение не подтвердилось. С использованием гидрофобной хроматографии удалось четко разделить алкоголь- и глицеролдегидрогеназу. При этом алкогольдегидрогеназа не катализировала НАД-зависимое окисление глицерина, а глицеролдегидрогеназа, в свою очередь, не проявляла алкогольдегидрогеназной активности. Исходя из полученных результатов, можно полагать, что у дрожжей C. valida имеется фермент, специфичный для глицерина и катализирующий его окисление с НАД в качестве кофактора. НАДФ-зависимого окисления глицерина в экстракте изучаемых дрожжей не обнаружено, отсутствовала также и активность глицеролоксидазы.

Такие различия в путях метаболизма глицерина можно объяснить физиологическими особенностями исследуемых дрожжей: Y. lipolytica – строго аэробный организм, в то время как C. valida являются дрожжами бродильного типа. Побочным продуктом при брожении является глицерин. Образование глицерина происходит из-за избытка НАДН, появляющегося при ассимиляции сахара в биомассу (Hofmann, 1983). Глицеролдегидрогеназа способна катализировать реакцию восстановления диоксиацетона в глицерин при физиологических условиях. Следовательно, можно предположить, что у дрожжей, способных к брожению, в аэробных условиях глицероддегидрогеназа может отвечать за первый этап ассимиляции глицерина, а при анаэробной ферментации сахаров служить клапаном для сброса восстановительных эквивалентов, катализируя образование глицерина. Известно также, что дрожжи C. valida при росте на глюкозе в условиях дефицита фосфора способны накапливать в среде глицерин (Еремина, Финогенова, 1990), а Y. lipolytica экскретирует в среду не глицерин, а лимонную кислоту (Лозинов, 1974). Способность накапливать в среде глицерин у разных видов дрожжей может быть связана с наличием или отсутствием глицеролдегидрогеназы.

Для более детального изучения путей метаболизма глицерина у Y. lipolytica и выяснения механизмов его регуляции глицеролкиназа была выделена, очищена и охарактеризована.

Очистка и свойства глицеролкиназы. Для очистки глицеролкиназы из дрожжей Y. lipolytica была разработана оригинальная, высокоэффективная методика, на которую былао получено авторское свидетельство. Очистка состояла из трех стадий (табл. 2). На первой стадии прогреванием экстракта удаляются менее термостабильные белки. Глицеролкиназа является термостабильным ферментом и выдерживает нагревание до 60 оС в течение 10 мин практически без потери активности. В то же время, тепловая обработка позволила избавиться более чем от 50% всего количества балластных белков. После тепловой обработке препарат фермента подвергали дополнительной очистке с помощью ионно-обменной и гидрофобной хроматографии. В результате глицеролкиназа была очищена более чем в 300 раз с выходом 51% и имела удельную активность 17,8 мкмоль/мин на мг белка.

Изучение физико-химических и кинетических свойств глицеролкиназы дрожжей Y. lipolytica показало, что фермент имел молекулярную массу 200 кДа, проявлял максимальную активность при pH=10,0, являлся термостабильным, ингибировался 0,5 мМ АМФ на 50 % и, был нечувствителен к фруктозо-1,6-бисфосфату.

Субклеточная локализация ферментов метаболизма глицерина у

Y. lipolytica и физиологическая роль глицерол-3-фосфат-дегидрогеназ. Первый этап превращения глицерина – фосфорилирование – локализован в цитоплазме. Доказательством этого служит тот факт, что 93% активности глицеролкиназы обнаруживалось в растворимой фракции после дифференциального центрифугирования. Следующий этап ассимиляции глицерина – дегидрирование образовавшегося в глицеролкиназной реакции глицерол-3-фосфата – может катализироваться двумя различными

Таблица 2. Очистка глицеролкиназы Y. lipolytica

Стадия очистки Общий белок (мг) Общая активность (Ед.) Удельная

активность

(мкмоль/мин

мг белка) Выход

(%) Степень очистки

Грубый экстракт 1320 77,9 0,059 100 1

Прогрев 510 77,5 0,152 99 2,6

ДЭАЭ-сефароза 32,4 48,6 1,5 62 25,4

Фенил-сефароза 2,3 40,9 17,8 51 301,3

оксидоредуктазами – ФАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназой и НАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназой. ФАД-зависимая глицерол-3-фосфат-дегидрогеназа ассоциирована с фракцией мембранных органелл. Более 75% активности этого фермента при дифференциальном центрифугировании обнаружено во фракции частиц. При этих же условиях примерно 70% активности фумаразы, маркерного фермента митохондрий, определялось в той же фракции. Одинаковый характер распределения этих двух ферментов позволяет предположить, что они ассоциированы с одной субклеточной органеллой.

Более 55% НАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы связано с фракцией частиц. Примерно также распределяются активности пероксисомальных ферментов (изоцитрат-лиазы и каталазы).

Теоретически можно предположить три метаболических функции для НАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы: восстановление диокси- ацетонфосфата для биосинтеза триглицеридов, окисление глицерол-3-фосфата, образовавшегося при ассимиляции глицерина, и поддержание редокс-потенциала.

Литературные данные о метаболической роли глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы из различных источников немногочисленны и противоречивы. Участие в поддержании редокс-состояния предполагается для фермента из мышц курицы (Wait, Kaplan, 1972) и дрожжей, ассимилирующих н-алканы (Kawamoto et al. 1979); катаболическая роль – для ферментов из Escherichia coli (Kito, Pizer, 1968), печени курицы (Harding, 1975) и Neurospora crassa (Courtright, 1975). Биосинтетическая роль обсуждалась для ферментов из Saccharomyces cerevisiae (Hofmann, 1983) и E. coli (Kito, Pizer, 1968).

Десятикратное увеличение активности НАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы наблюдалось в клетках Y. lipolytica, при росте на глицерине, по сравнению с клетками, выращенными на глюкозе (табл. 1). Казалось бы, что основная роль данного фермента в клетках заключается в дегидрировании глицерол-3-фосфата, образующегося в глицеролкиназной реакции. С другой стороны, японские исследователи предположили, что НАД-зависимая глицерол-3-фосфат-дегидрогеназа вовлечена в глицерол-3-фосфат-диоксиацетонфосфат-челночную систему, функционирующую в алкан-утилизирующих дрожжах. Данная система служит для транспорта восстановительных эквивалентов, образующихся в пероксисомах во время ?-окисления жирных кислот (Kawamoto et al., 1979).

Дрожжи Y. lipolytica, Trichosporon candida и Candida maltosa были выращены на глицерине и гексадекане, и в бесклеточных экстрактах дрожжей определены активности ферментов начальных этапов метаболизма глицерина. Активности этих же ферментов были определены у C. utilis, не способных ассимилировать н-алканы, и у метанольных дрожжей C. boidinii, выращенных на глицерине. Также были определены активности ферментов начальных этапов ассимиляции гексадекана. Результаты представлены в табл. 3. Активность НАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы в клетках дрожжей, выращенных на гексадекане, значительно выше, чем на глицерине.

Таблица 3. Активности ферментов (?моль/мин на мг белка) метаболизма глицерина и н-алканов у дрожжевых организмов

Фермент Y. lipolytica T. candida C. maltosa C. utilis C.boidinii

глице-рин гекса-декан глице-рин гекса-декан глице-рин гекса-декан глицерин гексадекан

Глицеролкиназа 0,105 0,021 0,121 0,065 0,095 0,029 0,172 0,073

Глицерол-3-Ф-дегидрогеназа (НАД+) 0,052 0,208 0,045 0,275 0,044 0,137 0 0

Глицерол-3-Ф-дегидрогеназа (ФАД+) 0,041 0,040 0,049 0,063 0,032 0,052 0,048 0,027

Цитохром Р-450 0,012 0,045 0,015 0,039 0,010 0,051 0 0

Оксидаза высших жирных спиртов 0,015 0,080 0,044 0,120 0,035 0,153 0 0

Дегидрогеназа высших альдегидов 0,034 0,096 0,075 0,180 0,064 0,179 н.о. н.о.

Ацил-КоА-оксидаза 0,023 0,109 0,056 0,115 0,045 0,120 н.о. н.о.

Изоцитрат-лиаза 0,030 0,089 0,039 0,123 0,042 0,122 н.о. н.о.

н.о. – не определя У дрожжей, не ассимилирующих н-алканы, этот фермент вообще не обнаружен. Активности ферментов, участвующих в метаболизме н-алканов (цитохром Р-450, оксидаза высших спиртов, дегидрогеназы высших альдегидов, ацил-КоА-оксидаза, изоцитрат-лиаза), у всех исследованных дрожжей были выше при росте на гексадекане. В тоже время активность ключевого фермента ассимиляции глицерина – глицеролкиназы – выше в клетках дрожжей, выращенных на глицерине. Активность ФАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы при выращивании дрожжей на глицерине и гексадекане изменялась незначительно. Эти результаты дают возможность предположить, что основная физиологическая роль НАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы связана не с ассимиляцией глицерина, а с метаболизмом н-алканов. В окислении глицерол-3-фосфата, образующегося в глицеролкиназной реакции, основную роль, по-видимому, играет ФАД-зависимая глицерол-3-фосфат-дегидрогеназа.

Таким образом, у Y. lipolytica (рис. 1) вовлечение глицерина в обмен происходит посредством его фосфорилирования глицеролкиназой. Окисление образовавшегося глицерол-3-фосфата в диоксиацеионфосфат осуществляется при участии ФАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы.

Рис. 1. Окисление глицерина у Y. lipolyticа (1 - глицеролкиназа, 2 - глицерол-3-Ф-дегидрогеназа (ФАД), 3 – глицерол-3-Ф- дегидрогеназа (НАД), 4 – триозофосфат-изомераза).

Особенности ассимиляции триглицеридов растительных масел и продуктов их гидролиза у Y. lipolytica. Начальным этапом ассимиляции триглицеридов у дрожжей является их гидролиз с образованием глицерина и жирных кислот:

Гидролиз осуществляется внеклеточными липазами (Fickers et al., 2005). До настоящего времени не были определены механизмы ассимиляции продуктов гидролиза. Предполагалось, что могут быть реализованы два механизма потребления этих субстратов: одновременное потребление глицерина и жирных кислот или последовательное потребление вначале одного, потом другого метаболита (т.е. диауксия).


загрузка...