Метаболическая организация окислительных путей у дрожжей Yarrowia lipolytica – продуцентов органических кислот (31.08.2009)

Автор: Моргунов Игорь Григорьевич

Материалы диссертационной работы используются в лекциях для профессорско-преподавательского состава ВУЗов РФ.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены, обсуждены и опубликованы в материалах следующих симпозиумов и конференций: на четырнадцатой конференции "Транспорт и энергетика дрожжей" (Бонн, Германия, 1996), на третьей международной конференции по Y. lipolytica (Дрезден, Германия, 2002), на первом и втором международных конгрессов федерации европейских микробиологов (Любляна, Словения, 2003 и Мадрид, Испания, 2006), на девятнадцатом международном симпозиуме, посвященном достижениям в микробной безопасности пищевых продуктов (Порторош, Словения, 2004), на втором греческом симпозиуме биотехнологов (Афины, Греция, 2005), на международных конференциях «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии” (Минск-Раков, Беларусь, 2006, 2007), на ежегодных международных конференциях Института биотехнологии "Биохимия и биотехнология микроорганизмов – продуцентов органических кислот" (Авги-Салоники, Греция, 2006, 2007, 2008), а также на ежегодных Отчетных сессиях ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН (1994-2008).

Конкурсная поддержка работы. Исследования проводились в 1985-2009 гг. в Лаборатории аэробного метаболизма микроорганизмов ИБФМ РАН. На протяжении всего этого периода исследования были частью плановых НИР. Исследования были поддержаны федеральной целевой научно-технической программой "Исследования и разработки по приоритетным направлениям науки и техники на 2002-2006 гг.” (госконтракт № ИФ-15/02-2006), Российским фондом фундаментальных исследований, международным грантом CRDF RBO – 10305, и договорами с ООО «Зеленые линии» и ООО «НТМ-ФАРМ».

Личный вклад автора заключается в проведении экспериментальных и теоретических исследований. Основные результаты работы получены лично автором или под его непосредственным руководством. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях. Автору принадлежит ведущая роль в выборе стратегии исследования, разработке новых подходов к решению экспериментальных задач, в обсуждении и обобщении полученных результатов и написании публикаций.

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 54 печатные работы, в том числе, 28 статьи (в их числе 3 обзора) из списка журналов ВАК, рекомендуемых для докторских диссертаций.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследований, изложение полученных результатов и их обсуждение, заключения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 329 страницах, содержит 44 таблицы и 51 рисунков. Список литературы включает 434 наименований, из них 330 – публикации в иностранных изданиях.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. В обзоре обсуждаются современные достижения в области изучения неконвенционных дрожжей Y. lipolytica, физиологические основы биосинтеза органических кислот – интермедиатов ЦТК, регуляция ключевых ферментов ЦТК и глиоксилатного цикла у микроорганизмов, а также структурно-функциональная организация ферментов матрикса митохондрий.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Материалы. Реактивы, используемые для приготовления минеральных сред, были аналитической чистоты («Реахим», СССР). В работе использовали коммерческие ферментные препараты и биохимические реактивы фирм «Roche» (Германия), «Sigma» (США), «P-L Biochemicals» (США), «Amersham», США), хроматографические материалы были получены от фирмы «Pharmacia» (Швеция).

Микроорганизмы. В работе использовали природные штаммы дрожжей Y. lipolytica из коллекции культур ИБФМ РАН и мутантные штаммы, полученные путем комбинированной обработки природного штамма Y. lipolytica 704 (ВКМ Y-2373) ультрафиолетовым облучением и N-метил-N-нитро-N-нитрозогуанидином. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae ATCC 26108 (S288C) и бактерии Escherichia coli XL1-Blue, которые использовались для молекулярно-биологических исследований, были получены из коллекции Департамента биохимии Университета Далласа.

Методы культивирования. Дрожжи культивировали в колбах на качалке или в ферментере АНКУМ-2М (Россия) объемом 3 л (исходный объем среды 1,5 л) и объемом 10 л (исходный объем среды 5,0 л) общепринятыми методами в минерально-солевой среде Ридер. Источником углерода и энергии служили рапсовое и подсолнечное масла, глицерин, глюкоза, олеиновая кислота. В ряде случаев рост дрожжей лимитировали тиамином (в случае продукции кетокислот) или азотом (в случае продукции лимонных кислот).

Активность ферментов определяли на спектрофотометре UV-160 «Shimadzu» (Япония) в бесклеточных гомогенатах клеток, отобранных в разные фазы роста. Дезинтеграцию дрожжей проводили на планетарной мельнице с помощью «баллотини» или на прессе Френча. Методы измерения активности ферментов подробно изложены в диссертации. Единицу активности определяли как количество фермента, катализирующего превращение одного мкмоль субстрата или образование одного мкмоль продукта в минуту (Ед.).

Очистку ферментов проводили с использованием носителей и колонок фирмы «Pharmacia» (Швеция). Молекулярную массу нативных препаратов ферментов определяли методом гель-фильтрации. Чистоту белковых препаратов и молекулярную массу субъединиц определяли электрофорезом в 10%-ном ПААГ в присутствии SDS по модифицированному методу Лэммли (Laemmli, 1970). Окрашивание препаратов белка проводилось Coomassie R-250.

Экстракция нуклеотидов. НАД и адениновые нуклеотиды экстрагировали кислотой, а НАДН щелочью. Для этого к 20 мл клеточной суспензии, отобранной непосредственно из ферментера, быстро добавляли по 7 мл 0,3 N HCl или 1 N NaOH. Суспензию инкубировали на водяной бане при 500 С в течение 10 мин при постоянном перемешивании, охлаждали и нейтрализовали до рН=7,0. Нейтрализованный экстракт центрифугировали при 10000 g в течение 10 мин, и супернатант использовали для анализа нуклеотидов. Анализ адениннуклеотидов проводили люциферин-люциферазным методом на люминометре LKB 1261 (Швеция). АМФ и АДФ определяли после энзиматической конверсии в АТФ. Пиридиннуклеотиды определяли циклическим методом на спектрофотометре UV-160 «Shimadzu» (Япония).

Получение пермеабилизованых клеток. Пермеабилизацию Y. lipolytica проводили модифицированным методом Yoshina et al. (1979). 1 г (по сух. весу) клеток суспендировали в 4 мл 100 мМ калий-фосфатного буфера (pH=7,5), содержащего 40 мМ сорбитола. К суспензии клеток добавляли 15 мл толуола. Суспензия аккуратно перемешивалась при 37 0С в течение 5 мин и потом охлаждалась на льду. Клетки были собраны центрифугированием при 10 000 g в течение 10 мин, ресуспендированы и отмыты в 20 мМ какодилатном буфере (pH=7,1), содержащем 400 мМ сорбитола. Клетки, обработанные толуолом, суспендировали в вышеприведенном буфере в конечной концентрации 200 мг клеток/мл.

Связывание цитратсинтазы Y. lipolytica с внутренней мембраной митохондрий. Для выделения митохондрий клетки Y. lipolytica дважды промывали дистиллированной водой и суспендировали в среде, содержащей 0,9 М сахарозы, 20 мМ фосфатного буфера (pH=6,0), 1 мМ ЭДТА и 3% лиофилизированного желудочного сока виноградной улитки. Суспензию клеток инкубировали с перемешиванием при 29 0 С в течение 90 мин. Затем клетки дважды промывали средой того же состава без улиточного фермента и центрифугировали при 6000 g 20 мин. Отмытые клетки суспендировали в среде, содержащей 0,5 М манита, 10 мМ фосфатного буфера (pH=7,2), 0,5 мМ ЭДТА и 0,1 % БСА.

Суспензию клеток гомогенизировали при 14000 об./мин в течение 20 мин. Клетки центрифугировали при 3000 g 10 мин для удаления неразрушенных клеток и протопластов. Митохондрии осаждали при 7000 g 10 мин. Осадок митохондрий (10 мг/мл) хранили на льду.

Для удаления внешней мембраны и получения митопластов митохондрии обрабатывали 0,75% раствором дигитонина в течение 10 мин (Greenawalt, 1974). Cубмитохондриальные частицы (СМЧ) получали с помощью обработки митопластов ультразвуком (Hackenbrock and Hammon, 1975). Митопласты (50 мг по белку) суспендировали в 25 мл дистиллированной воды, центрифугировали при 10000 g в течение 10 мин, ресуспендировали в 1 мл воды и обрабатывали ультразвуком (20 кГц/сек, 40 Ватт) на льду. Обработку повторяли 8 раз по 15 сек и последний раз - 30 сек. Полученный препарат центрифугировали (10000 g, 10 мин) для удаления больших “невывернутых” везикул. СМЧ промывали 2 мМ HEPES буфером, рН=7,0 (буфер А) и собирали центрифугированием при 100 000 g в течение 1 ч.

Для электронного микроскопирования препараты мембран со связанными ферментами помещали на никелевые сетки. После промывки буфером А с 2% альбумином, сетки инкубировали с первичными антителами для цитратсинтазы (30 мин, 4 0С), промывали и переносили в смесь вторичных антител, коньюгированных с коллоидным золотом (Amersham, США), для мечения цитратсинтазы использовали частицы золота диаметром 15 нм. После инкубации (30 мин при 4 0C) и отмывки, препарат фиксировали в 2 % растворе глутарового альдегида, и сетки анализировали на электронном микроскопе EM301 (Phillips, США).

Наличие субстратного канала оксалоацетата внутри комплекса ферментов цитрат-синтазы и малатдегидрогеназы было подтверждено с использованием 1) рекомбинантного дрожжевого белка цитрат-синтаза/малатдегидрогеназа и 2) коммерческих препаратов малатдегидрогеназы (митохондриальной и цитозольной) и цитратсинтазы фирмы Sigma методами Hummer-Dreyer хроматография и осаждением комплекса ферментов в полиэтиленгликоле (ПЭГ). Методы анализа подробно изложены в диссертации.

Метаболические эффекты дислокализации цитрат-синтазы определяли в клетках дрожжевых мутантов cit1 (cit1::LEU2) и cit1cit2 (cit1::LEU2 cit2::URA2), неспособных к росту на ацетате. Методы анализа подробно изложены в диссертации.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Пути метаболизма глицерина и растительных масел у дрожжей Y. lipolytica. В настоящее время известно два основных пути метаболизма глицерина у дрожжей:

1) фосфорилирование глицерина глицеролкиназой (КФ 2.7.1.30) с образованием глицерол-3-фосфата и последующее дегидрирование до диоксиацетонфосфата ФАД-зависимой глицерол-3-фосфатдегидрогеназой (КФ1.1.99.5) и НАД-зависимой глицерол-3-фосфатдегидрогеназой (К.Ф. 1.1.1.8) (фосфорилирующий путь);

2) окисление глицерина глицеролдегидрогеназой (КФ 1.1.1.6) и фосфорилирование образовавшегося диоксиацетона диоксиацетонкиназой (КФ 2.7.1.28) (окислительный путь).

Ранее фосфорилирование глицеролкиназой считалось единственным механизмом вовлечения глицерина в метаболизм дрожжей. Для ряда дрожжей описан окислительный путь, в котором глицерин окисляется до диоксиацетона, и последний фосфорилируется до диоксиацетонфосфата (May and Sloan, 1981).

Пути метаболизма глицерина у Y. lipolytica – продуцентов органических кислот были изучены в сравнении с Candida valida (продуцентом цитохрома с). Результаты определения активности ферментов, катализирующих начальные этапы как фосфорилирующего, так и окислительного путей метаболизма глицерина, в бесклеточных экстрактах Y. lipolytica и C. valida представлены в табл. 1. Ферменты, катализирующие реакции окислительного пути НАД- и НАДФ-зависимая глицеролдегидрогеназа, диоксиацетонкиназа и глицерол-оксидаза не обнаружены в грубых экстрактах клеток Y. lipolytica. Высокие активности глицеролкиназы и НАД- и ФАД- глицерол-3-фосфатдегидрогеназ и индуцибельный характер этих ферментов позволяет предположить, что у

Таблица 1. Активности ферментов (?моль/мин мг белка) метаболизма глицерина

Фермент Y. lipolytica C. valida

Глицерин Глюкоза Глицерин

Фосфорилирующий путь

Глицеролкиназа 0,105 0,047 0

Глицерол-3Ф-дегидрогеназа (НАД+) 0,052 0,005 0

Глицерол-3Ф-дегидрогеназа (ФАД+) 0,041 0,003 0

Окислительный путь

Глицеролдегидрогеназа (НАД+) 0 н.о. 0,300

Диоксиацетонкиназа 0 н.о. 0,081

Глицеролдегидрогеназа (НАДФ+) 0 н.о. 0

Глицеролоксидаза 0 н.о. 0


загрузка...