Метаболическая организация окислительных путей у дрожжей Yarrowia lipolytica – продуцентов органических кислот (31.08.2009)

Автор: Моргунов Игорь Григорьевич

Б – электронная микроскопия СМЧ с метками коллоидного золота

Фермент-ферментные взаимодействия между цитратсинтазой и малатдегидрогеназой в полиэтиленгликоле. Необходимо отметить, что существует ряд методологических проблем в демонстрации фермент-ферментных взаимодействий. Большинство этих взаимодействий очень слабо, и это часто приводит к разрушению метаболонов во время изоляции комплекса при сильном разбавлении или изменениях в ионной силе буфера.

Целью данного раздела работы являлось изучение возможности образования комплекса между митохондриальными ферментами ЦС и малат-дегидрогеназы (МДГ) в присутствии неионного детергента – полиэтиленгликоля (ПЭГ). Использование растворов неионных полимеров, таких как ПЭГ, моделирует условия митохондриального матрикса. Для регистрации фермент-ферментного взаимодействия между ЦС и митохондриальным или цитоплазматическим изоферментами МДГ (мМДГ или цМДГ, соответственно) применяли метод фронтальной равновесной гель-фильтрации в ПЭГ. Колонка Superdex S-200 была уравновешена 10 мM калий фосфатным буфером (pH=8,0), содержащим 10 % ПЭГ. На колонку наносили мМДГ, объем фронтальной элюции мМДГ составлял 15 мл (рис. 8). Затем колонку уравновешивали с тем же буфером, содержащим 0,2 мг/мл ЦС. На колонке, уравновешенной ЦС, объем фронтальной элюции мМДГ понижался до 5 мл. То есть мМДГ элюировалась в объеме, соответствующем белку с большей молекулярной массой, чем молекулярная масса свободного фермента. Это позволяло предположить образование комплексов между молекулами ЦС и мМДГ. Аналогичные эксперименты были проведены с цМДГ, комплексов между ЦС и цМДГ не образовывалось, цМДГ элюировались в одном и том же

объеме вне зависимости от отсутствия или присутствия ЦС на колонке. Таким образом, снижение объема фронтальной элюции мМДГ в присутствие ЦС демонстрирует специфическое взаимодействие между мМДГ и ЦС. Необходимо отметить, что ферменты, по-видимому, формируют комплексы, состоящие из нескольких молекул. Объем элюции мМДГ в присутствие ЦС был меньше, чем объем элюции калибровочного белка с наибольшей молекулярной массой – тироглобулина (М.м.=669 кДа).

Также было проведено изучение комплексов ЦС/МДГ в ПЭГ, образцы комплексов ЦС/МДГ (с концентрациями белков 2 мг/мл) инкубировали в средах с различными концентрациями ПЭГ (0-30%) и ионной силы (10 мМ KH2PO4 или 200 мМ KH2PO4) в течение 2 мин. После этого диссоциацию комплекса ЦС/МДГ оценивали как уменьшение плотности суспенции при 650 нм (рис. 9). Следует отметить, что комплексы ЦС/МДГ быстро диссоциируют при инкубации без добавления ПЭГ (ОП при 650 нм быстро понижается). Однако, когда твердо-фазную суспензию ЦС/МДГ инкубировали в присутствии 30% ПЭГ при низкой ионной силе (10 мМ KH2PO4) изменения в мутности суспензии не было обнаружено. Увеличение в ионной силе (200 мМ KH2PO4) при 30% ПЭГ вызывало диссоциацию комплекса ЦС/мМДГ.

Чтобы показать кинетические преимущества комплекса ЦС/МДГ, ассоциированного в ПЭГ, мы использовали два фермента - “ловушки” – аспартат-аминотрансферазу (ААТ) и оксалоацетат-декарбоксилазу (OAДК). Общим субстратом для этих ферментов является оксалоацетат (ОАА), следовательно в сопряженных реакциях ААТ и ОАДК могут конкурировать за субстрат с ЦС.

Рис. 9. Влияние концентрации ПЭГ и ионной силы на диссоциацию комплексов между ЦС и мМДГ (А) и ЦС и цМДГ (В).

Схема конкурентных взаимоотношений МДГ/ЦС, ААТ и OAДК за ОАА представлена на схеме:

Концентрации ферментов – 0,2 Ед./мл ЦС, 0,4 Ед./мл мМДГ или цМДГ и 10 Ед./мл ААТ или OAДК. Начальная скорость сопряженной реакции в 20% ПЭГе была в 4 раза меньще по сравнению с реакционной смесью без ПЭГ (контроль). Концентрация ПЭГ, изоформы МДГ (мМДГ или цМДГ) и ионная сила показывали различное кинетическое поведение сопряженных систем ЦС/мМДГ и ЦС/цМДГ с ААТ. В случае реакционной смеси без ПЭГ (т.е. когда не образуется фермент-ферментного комплекса МДГ/ЦС), скорость сопряженной реакции (т.е. образование коэнзима А), была снижена до 26 - 28% от контроля в присутствии ААТ, что демонстрировало хорошее улавливание ОАА ферментом-ловушкой. В 30% ПЭГ, скорость сопряженной реакции снижалась только на 40% в присутствии ААТ для комплекса ЦС/мМДГ, и только - на 78 % в комплексе ЦС/цМДГ (рис. 10).

Рис. 10. Влияние ААТ и ОАДК на сопряженную

реакцию, катализируемую мМДГ или цМДГ.

Увеличение ионной силы (добавлением KН2PO4 до концентрации 200 мM) приводило к 3-х кратному снижению скорости сопряженной реакции с ААТ в комплексе ЦС/мМДГ. При высокой ионной силе ОАА, образованный в маладегидрогеназной реакции, не передавался на активный центр ЦС, а выходил в раствор и превращался в реакции с ААТ. Это могло свидетельствовать о том, что субстратный канал для ОАА внутри комплекса ЦС/мМДГ имеет электростатическую природу. Подобные результаты были получены и с другим ферментом - “ловушкой” – OAДК.

Можно было предположить, что причина снижения чувствительности ЦС/мМДГ к ферментам – “ловушкам” заключается в том, что диффузия OAA из ферментных комплексов в ПЭГ затруднена. Однако мы показали, что твердо-фазный комплекс ЦС/цМДГ проявляет такую же чувствительность к AAT и ОАДК, как и свободные ферменты. Поэтому можно сделать вывод, что внутри комплекса, образуемого ЦС и мМДГ существует специфический субстратный канал, по которому ОАА передается с активного центра одного фермента на активный центр другого без выхода в раствор. Это может предоставлять клетке кинетические преимущества, так как субстрат одного метаболического пути не может быт захвачен ферментами другого пути и выведен из метаболического потока.

Субстратный канал для ОАА внутри слитого белка ЦС-МДГ. Возможность существования субстратного канала для ОАА между ЦС и МДГ была подтверждена нами при изучении слитого белка, содержащего два дрожжевых митохондриальных фермента ЦС и МДГ.

Был сконструирован рекомбинантный белок (рис. 11), в котором С-конец ЦС был слит с N-концом МДГ. Полученная плазмида pODC29/ЦС1/МДГ1 кодировала последовательность из шести гистидиновых остатков СS1, линкер (Gly-Ser-Gly) и MDH1. Для наработки фьюжн-протеина вектор pODC29/ЦС1/МДГ1 был трансформирован в E. coli BL21/DE3.

Рекомбинантный белок ЦС/МДГ был очищен с помощью хроматографии на никель-агарозе и последующей гель-фильтрации. Удельные активности в очищенном препарате составляли 71 мкмоль/мин мг белка для ЦС и 910 мкмоль/мин мг белка для МДГ.

Наличие пространственной близости между ЦС и МДГ в слитом белке позволяло предположить формирование комплекса между ферментами и, как следствие, возникновение внутри этого комплекса субстратного канала для ОАА.

Сопряженную реакцию проводили также, как в случае с комплексами ферментов в ПЭГ. Слитый белок был менее чувствителен к влиянию ААТ по сравнению со свободными ферментами (рис. 12). При проведении сопряженной реакции в условиях высокой ионной силы кривые зависимости скорости реакции от коцентрации ААТ были практически одинаковы как для слитого белка, так и для свободных ферментов. Полученные результаты могут служить подтверждением предположения о наличие электростатического канала для ОАА внутри комплекса, образуемого ЦС и МДГ.

Метаболические эффект дислокализации цитрат-синтазы в клетках дрожжей. В клетках млекопитающих ЦС, по-видимому, локализована исключительно в митохондриях. В клетках дрожжей и растений, второй изофермент, локализованный в пероксисомах, вовлечён в глиоксилатный цикл (ГЦ) - анаплеротический путь ЦТК. В дрожжах Saccharomyces cerevisiae, активности митохондриальной и внемитохондриальной ЦС кодируются определёнными ядерными генами, CIT1 (Suissa, Sude, Schatz, 1984) и CIT2 (Kim, Rosenkrantz, Guarente, 1986; Rosenkrantz et al. 1990), соответственно. Пероксисомальная локализация Сit2p опосредована наличием С-терминального трипептида SKL (Lewin, Hines, Small, 1990; McCammon et al. 1990; Singh, Small, Lewin, 1992). Белок Cit1p, на 81%, идентичный по аминокислотному составу Cit2p, имеет на С-конце трипептид SKN, который определяет митохондриальную локализацию белка. Кроме того, показано, что третий ген СIT3 кодирует вторую митохондриальную изоформу ЦС у S. cerevisiae, но условия функционирования и экспрессии cit3p не были объяснены (Jia, Becam, Herbert, 1997). Мутант, с делецией гена CIT2 абсолютно жизнеспособен и не проявляет каких-либо особых фенотипических отличий от родительского типа. Мутант, лишенный CIT1 не растёт в среде с ацетатом в качестве единственного источника углерода. Это представлялось неожиданным, поскольку внутренняя мембрана митохондрий обеспечена транспортёром цитрата (Chapell and Haaroff, 1967), который позволяет Cit2р заменить Cit1p.

Рис. 12. Влияние ААТ на сопряженную реакцию, катализируемую свободными ферментами ЦС и МДГ и слитым белком ЦС/МДГ.

Целью данного раздела работы было дальнейшее изучение идеи о мультиферментном комплексе внутри ЦТК и оценка способности изоферментов, катализирующих одну и ту же реакцию, но имеющих структурное различие, функционировать в альтернативных клеточных компартментах и метаболических путях. Мы исследовали способность белка Сit1p, обычно обнаруживаемого в митохондриях, функционировать в цитозоле, и способность белка Сit2p, обычно обнаруживаемого в пероксисомах, функционировать в митохондриях. Более того, мы очистили белки Сit1p, Сit2p и Mdh1р с тем, чтобы проверить способность Сit1p и Сit2p взаимодействовать in vitro с митохондриальной малатдегидрогеназой (Mdh1р) в твердо-фазном комплексе в присутствии ПЭГ, как это было проведено с коммерческими ферментами в предыдущем разделе.

Дрожжевые null-мутанты ?cit1 и двойной мутант ?cit1?cit2 были не способны расти в среде, содержащей ацетат в качестве единственного источника углерода. Путем трансформации в них встроены плазмиды: pRS-C-CIT1 кодирует нативный белок Cit1p; pRS-C-?LSCIT1- белок Cit1p без SKN, ответственной за локализацию в митохондрии; pRS-Е-?LSCIT1- мультикопийный Cit1 без SKN; pRS-C-LSCIT2?SKL - белок Cit2p без SKL,

pRS-C-LSCIT2SKN - белок Cit2p с SKN вместо SKL.

Селекцию трансформантов проводили в синтетической полной среде с глюкозой без триптофана и проверяли их на способность к росту в среде с ацетатом (рис. 13). Трансформант не восстанавливал способности к росту на ацетате при экспрессии CIT2, не способной проникать в митохондрии, 2) При экспрессии в мутантном штамме CIT2 с лидерной последовательностью способность к росту на ацетате восстанавливалась.

Рис. 13. Способность плазмид-несущих конструкций восстанавливать рост мутантных штаммов на среде с ацетатом.

Описанные выше результаты показали, что цитозольный белок Cit2p, когда локализован в митохондриях, способен метаболически подражать митохондриальному белку Cit1p. Согласно идеи мультиферментого комплекса ЦТК, эти данные позволяют предположить, что как Cit2p, так и Cit1p, могут встраиваться в этот комплекс.

Для проверки способности дрожжевых ферментов ЦС, митохондриальной (Cit1p) и цитозольной (Cit2p) локализации, взаимодействовать с дрожжевой митохондриальной МДГ (Mdh1p) в присутствии ПЭГ, кодирующие области генов CIT1, CIT2, и MDH1 клонировали в бактериальный вектор pPROEX-1 (где они были встроены в рамку считывания с 5??конца в последовательность, кодирующую шесть последовательных гистидиновых остатка). Все три гистидин-меченных белка были экспрессированы в бактериях и очищены на никель-агарозе. Как показано на рис. 14, как Cit2p, так и Cit1p, взаимодействовали с Mdh1p в присутствии 14% ПЭГ, и это даёт основание предположить, что пероксисомальная изоформа ЦС, при дислокации в митохондрии, может принимать участие в работе мультиферментного комплекса ЦТК.

Способность двух изоферментов ЦС замещать друг друга внутри пространственной структуры требует того, чтобы эти два белка проявляли высокое структурное сходство их внешней поверхности. На рис. 15 представлены молекулярные поверхности изоформ ЦС в трёх различных положениях. На этих моделях чётко видно, что два изофермента имеют высокое сходство в структуре внешней поверхности, так, что они почти неразличимы друг от друга. Существует подавляющее сходство между двумя электростатическими профилями этих двух изоферментов.

Рис.15. Структура поверхностей и электростатические заряды ЦС1 и ЦС2.

Красные области – положительно-заряженные участки; синие – отрицательно

Каждый белок представлен в трех ориентациях, полученных последовательным вращением молекул на 90 0. Стрелка указывает на активный центр.

Одно из возможных преимуществ организации ферментов в метаболоны состоит в том, что непосредственная близость ферментов, ответственных за последовательные шаги метаболического пути, увеличивает утечку интермедиата именно через этот путь и предотвращает выход интермедиата в раствор, где он может быть использован другими ферментами в других метаболических путях.

Впервые установлены пути метаболизма триглицеридов и продуктов их гидролиза у дрожжей Y. lipolytica. Первым этапом вовлечения триглицеридов в метаболизм является их гидролиз внеклеточными липазами. Продукты гидролиза триглицеридов - жирные кислоты и глицерин потребляются клетками одновременно. Вовлечение глицерина в обмен происходит посредством его фосфорилирования глицеролкиназой. Окисление образовавшегося глицерол-3-фосфата в диоксиацетонфосфат осуществляется при участии ФАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы.

Изучены механизмы регуляции сверхсинтеза органических кислот у

Y.lipolytica. Ключевая роль отводится регуляции НАД- изоцитратдегидрогеназы уровнем АМФ и соотношением НАДН/НАД+. Лимитирование роста дрожжей азотом приводит к остановке биосинтеза азотсодержащих соединений и снижению их содержания в клетке. В результате этого происходит возрастание соотношений АТФ/АМФ и НАДН/ НАД+, что свидетельствует о повышенном обеспечении клеток энергетическими и восстановительными эквивалентами и блокировке изоцитратдегидрогеназы. В результате образуются значительные количества лимонных кислот в клетке и выделение этих метаболитов в культуральную жидкость. При лимитировании роста тиамином клетки находятся в состоянии низкой обеспеченности энергетическими и восстановительными эквивалентами. Блокирование метаболического потока осуществляется на уровне тиаминзависимых ферментов: 2-оксоглутарат-дегидрогеназы и пируватдегидрогеназы, в среду выделяются кетокислоты.

3. Липаза (КФ 3.1.1.3), глицеролкиназа (КФ 2.7.1.30), НАД+-зависимая изоцитратдегидрогеназа (КФ 1.1.1.41) и цитратсинтаза (КФ 4.1.3.7) Y. lipolytica выделены, очищены и охарактеризованы. Исследованы механизмы регуляции этих ферментов интермедиатами ЦТК. Показано, что свойства цитратсинтазы в условиях in vitro и in situ существенно различаются; фермент in situ оказался более устойчивым к ингибирующему воздействию цитрата и АТФ.

Установлены новые принципы метаболической организации дрожжей. Между ферментами существуют фермент-ферментные взаимодействия. Такие взаимодействия выявлены между двумя последовательными ферментами ЦТК - цитратсинтазой и малатдегидрогеназой. Фермент-ферментный комплекс образует электростатический субстратный канал для оксалоацетата. На примере пероксисомальной цитрат-синтазы впервые показана важность третичной структуры фермента для его функционирования в составе метаболона.

Ферменты ЦТК способны связываться как между собой, так и с внутренней мембраной митохондрий, образуя надмолекулярные комплексы (метаболоны). Такая организация метаболического пути способствует 1) формированию субстратных каналов, при котором субстраты передаются от одного фермента к последующему без выхода в раствор; 2) созданию микроокружения, в котором концентрация субстратов существенно повышается и 3) эффективной и направленной регуляции клеточного метаболизма.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Anasstasiadis S., Morgunov I.G., Kamzolova S.V., Finogenova T.V. Citric acid production patent review // Recent Patents on Biotechnology. 2008. V. 2. N 3. P. 103-120.


загрузка...