Метаболическая организация окислительных путей у дрожжей Yarrowia lipolytica – продуцентов органических кислот (31.08.2009)

Автор: Моргунов Игорь Григорьевич

МОРГУНОВ ИГОРЬ ГРИГОРЬЕВИЧ

МЕТАБОЛИЧЕСКАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ОКИСЛИТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ

У ДРОЖЖЕЙ YARROWIA LIPOLYTICA – ПРОДУЦЕНТОВ ОРГАНИЧЕСКИХ КИСЛОТ

03.00.04 – Биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Пущино - 2009

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор,

заслуженный деятель науки РФ Татьяна Васильевна Финогенова

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Миронова Галина Дмитриевна

доктор биологических наук, профессор Звягильская Рената Александровна

доктор биологических наук, профессор Бурьянов Ярослав Иванович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт биофизики клетки РАН

Защита диссертации состоится “ 26 ” ноября 2009 г. в 14 час 30 мин

на заседании диссертационного совета Д 002.121.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской обл., проспект Науки, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН.

Автореферат разослан “ ” 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор биологических наук В.М. Вагабов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Последние годы характеризуются возрастанием интереса к исследованию неконвенционных дрожжей Yarrowia lipolytica, что обусловлено, с одной стороны, их отличием от хорошо изученных дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Schizosaccharomyces pombe в плане их филогенетической эволюции, физиологии и генетики (Barth and Gaillardin, 1996; 1997) и, с другой стороны, широким применением их в биотехнологии. Создан международный центр по координации исследований в данной области; международные конференции, посвященные изучению этих дрожжей, проводятся с 1995 г. каждые три года. Значительные успехи достигнуты в области молекулярной биологии и генно-инженерной экспериментальной биологии Y. lipolytica; усилиями нескольких европейских научных коллективов к 2004 г. завершено изучение генома дрожжей, и составлена их генетическая карта (Dujon et al. 2004).

Российская группа, входящая в международный консорциум, на приоритетной основе проводит исследование уникальной особенности дрожжей Y. lipolytica синтезировать в значительных количествах органические кислоты, липиды и ферменты. Физиологические основы образования этих продуктов у Y. lipolytica изучены достаточно хорошо при использовании н-алканов в качестве источника углерода и энергии. Однако биохимические аспекты ассимиляции источников углерода (и особенно новых возобновляемых субстратов, таких как растительные масла и глицерин) и механизмы сверхсинтеза органических кислот на этих субстратах остаются малоизученными. Все энзиматические исследования по изучению процессов сверхсинтеза органических кислот - интермедиатов ЦТК - проводились на бесклеточных экстрактах дрожжей. Не были изучены физико-химические свойства ключевых ферментов, участвующих в ассимиляции субстратов и процессах сверхсинтеза, и механизмы их тонкой регуляции. Оставалось неизвестным влияние внутриклеточных концентраций метаболитов на регуляцию ферментов, обеспечивающих процесс сверхсинтеза органических кислот. На момент начала работы еще не было доказанным, что в клетке ферменты одного метаболического пути функционируют не разрозненно, а взаимодействуют между собой и со структурными элементами клетки и создают надмолекулярные комплексы – метаболоны. Исследование ферментов, в условиях, максимально приближенных к тем, которые существуют внутри клетки, открывает новые перспективы в понимании механизмов регуляции метаболизма микроорганизмов.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было изучение структурно-функциональной организации путей ассимиляции триглицеридов и глицерина у дрожжей Y. lipolytica и механизмов регуляции процессов сверхсинтеза органических кислот.

В соответствии с целью были определены следующие задачи:

Изучение путей метаболизма триглицеридов растительных масел и глицерина дрожжами Y. lipolytica.

Исследование механизмов сверхсинтеза органических кислот дрожжами Y. lipolytica при различных физиологических условиях (в условиях лимитирования роста клеток тиамином или азотом) на разных субстратах.

Выделение и характеристика ключевых ферментов метаболизма триглицеридов и глицерина и сверхсинтеза органических кислот - липазы (КФ 3.1.1.3), глицеролкиназы (КФ 2.7.1.30), НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы (КФ 1.1.1.41) и цитратсинтазы (КФ 4.1.3.7).

Изучение надмолекулярной организации ферментов ЦТК и механизмов регуляции у дрожжей. Создание новых представлений о механизмах сверхсинтеза органических кислот.

Научная новизна работы. Впервые установлены пути метаболизма триглицеридов и продуктов их гидролиза у дрожжей Y. lipolytica. Первым этапом вовлечения триглицеридов в метаболизм является их гидролиз внеклеточными липазами. Продукты гидролиза триглицеридов - жирные кислоты и глицерин потребляются клетками одновременно. Показано, что вовлечение глицерина в обмен происходит посредством его фосфорилирования глицеролкиназой. Окисление образовавшегося глицерол-3-фосфата в диоксиацетонфосфат осуществляется при участии ФАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы.

Ключевые ферменты ассимиляции метаболизма триглицеридов и глицерина – липаза (КФ 3.1.1.3) и глицеролкиназа (КФ 2.7.1.30) выделены, очищены и охарактеризованы.

Изучены механизмы регуляции ключевых ферментов ЦТК, участвующих в процессах сверхсинтеза органических кислот. НАД-зависимая изоцитратдегидрогеназа (КФ 1.1.1.41) и цитратсинтаза (КФ 4.1.3.7) из дрожжей Y. lipolytica выделены, очищены и охарактеризованы. Исследованы механизмы регуляции этих ферментов интермедиатами ЦТК. Показано, что кинетические свойства цитратсинтазы Y. lipolytica в условиях in vitro и in situ существенно различаются. Фермент в условиях in situ оказался значительно более устойчивым к ингибирующему воздействию цитрата и АТФ.

Установлены новые принципы метаболической организации дрожжей. Новизна предполагаемого подхода состоит в том, что ферменты одного метаболического пути впервые рассматриваются не в качестве отдельных функциональных единиц, а как элементы единого структурно-функционального комплекса. С использованием различных методологических подходов показано взаимодействие между двумя последовательными ферментами ЦТК - цитратсинтазой и малатдегидрогеназой. Фермент-ферментный комплекс образует электростатический субстратный канал для оксалоацетата.

Ферменты ЦТК способны связываться как между собой, так и с внутренней мембраной митохондрий, образуя надмолекулярные комплексы (метаболоны). Такая организация метаболического пути способствует 1) формированию субстратных каналов, при котором субстраты передаются от одного фермента к последующему без выхода в раствор; 2) созданию микроокружения, в котором концентрация субстратов существенно повышается и 3) эффективной и направленной регуляции клеточного метаболизма.

На примере пероксисомальной цитратсинтазы впервые показана важность третичной структуры фермента для его функционирования в составе метаболона.

Практическая значимость работы. На основании изучения метаболической организации путей ассимиляции триглицеридов растительных масел и глицерина дрожжей Y. lipolytica созданы научные основы для разработки микробиологических способов получения пировиноградной и лимонной кислот. Процессы получения лимонной кислоты из рапсового масла и пировиноградной кислоты из глицерина были воспроизведены в полупромышленных масштабах на Опытно-технологической установке ИБФМ РАН.

Разработаны простые оригинальные методы очистки внеклеточной липазы, глицеролкиназы, цитратсинтазы и НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы из Y. lipolytica. Глицеролкиназа может быть использована для определения глицерина в микробиологической и медицинской практике. Способ получения глицеролкиназы из дрожжей защищен авторским свидетельством № 1433980 (1988). Липаза из Y. lipolytica может применяться в технологических процессах получения ценных жирных кислот из отходов производства растительных масел, а также для замены каталитического метанолиза ферментативным при производстве биодизеля.


загрузка...