Роль стохастических факторов в процессе формирования первичных повреждений ДНК и хромосомных аберраций при воздействии радиации на соматические клетки млекопитающих in vitro и in vivo (31.01.2011)

Автор: Хвостунов Игорь Константинович

ОЛБ-III-IV (8 чел, 67 точек) 0,63±0,05 0,18±0,02 1,55±0,05 0,39±0,04 3,41±0,53

В настоящем исследовании установлено, что среднее число нестабильных спонтанных аберраций в аберрантных клетках равно (1,04), из них ацентрики, дицентрики и центрические кольца составляют 0,79; 0,18 и 0,07, соответственно. Следовательно, по разновидностям аберраций, содержащихся в аберрантных клетках, облучившиеся лица в отдаленном периоде отличаются от контрольной группы (табл. 3). В результате облучения среднее число радиационных маркеров оказывается в 2/3 раза выше в период до 40 лет после облучения. По этой причине частота дицентриков в лимфоцитах крови облучившихся лиц остается существенно выше спонтанного уровня даже при достижении такого уровня по доле аберрантных клеток.

Изменение с течением времени после облучения соотношения видов нестабильных аберраций в аберрантных клетках облучившихся лиц может являться следствием различий в способности аберраций передаваться дочерним клеткам. Известно, что наименьшей вероятностью характеризуются именно дицентрики (~50% в первом митозе), поэтому их доля с течением времени уменьшается. Однако сохраняющийся в организме облучившегося человека источник аберраций в виде облученных стволовых клеток может поддерживать повышенную частоту радиационных маркеров в соматических клетках человека длительное время после воздействия радиации.

Таким образом, показано, что пострадиационная динамика частоты нестабильных аберраций имеет двухфазный вид с быстрым спадом до 90% аберрантных клеток за 0,5/1,6 лет и последующим медленным снижением в течение 10/20 лет. Среднее число аберраций на одну аберрантную клетку за первые 10 лет снижается от величины 1,4/2,4 до постоянного значения порядка (1,0), что соответствует спонтанному уровню по сумме аберраций, но не по разновидностям. Так, без облучения в аберрантных клетках доля дицентриков составляет 18%, а в облученных аберрантных клетках - вначале 50/70%, а затем снижается до 30% в отдаленном периоде. Поэтому частота радиационных маркеров превышает спонтанный уровень до 40/50 лет после облучения.

При изучении динамики транслокаций в лимфоцитах облучившихся лиц возникают вопросы: “Снижается ли частота транслокаций со временем или она выходит на плато? Если плато существует, то в течение какого времени оно сохраняется и зависит ли эта частота транслокаций от дозы облучения?” Ответы были найдены путем анализа результатов обследования методом FISH, итоги которого представлены в табл. 4. Динамика транслокаций имела вид:

YTR=Y1 + (Y0 – Y1) exp(-t/T4),

где YTR– частота трансл/100GEкл, Y0– начальная частота, Y1–частота в отдален-ном периоде, T4 – характерное время снижения частоты транслокаций.

Таблица 4. Коэффициенты регрессионной зависимости от времени частоты транслокаций (tc+ti) /100GEкл в лимфоцитах крови облучившихся лиц.

Данные Параметры динамики транслокаций

Y0±SE Y1±SE T4±SE

ОЛБ-I (29 чел, 36 точек) 22,9±2,2 2,80±0,89 7,76±2,34

ОЛБ-II (14 чел, 23 точки) 46,6±3,8 8,45±0,88 6,17±0,87

ОЛБ-III (7 чел, 18 точек) 176,0±1,5* 23,7±0,9 1,23±0,23

ОЛБ-IV (1 чел, 3 точки) - - -

*оценка экстраполяцией на начальное время

На рис. 11 представлена динамика частоты транслокаций в лимфоцитах крови облучившихся лиц. Анализ результатов (рис. 11) показывает, что как начальная частота, так и частота транслокаций в отдаленном периоде возрастают с ростом степени тяжести ОЛБ. Во всех подгруппах получена качественно одинаковая динамика с характерным временем снижения в пределах 1,2/7,8 лет. Для подгрупп c ОЛБ II–IV частоты транслокаций выше спонтанного уровня вплоть до 50 лет после облучения. В подгруппе с ОЛБ–I эта частота превышает спонтанный уровень только в первые 20 лет после облучения. Кратность снижения с течением времени частоты транслокаций (Y1/Y0) составляет 0,12; 0,18; и 0,13 для трех групп, соответственно.

Для исследования возможности оценки частоты транслокаций путем подсчета АМ стандартным методом была проанализирована динамика АМ, которая показала схожие с транслокациями результаты (табл. 5). Так, начальная частота АМ и их частота в отдаленном периоде возрастают с ростом степени тяжести ОЛБ. Во всех подгруппах наблюдается качественно одинаковая динамика с характерным временем снижения в диапазоне от 3 до 11 лет.

Рис. 11. Зависимость от времени после облучения частоты наблюдаемых транслокаций в лимфоцитах крови облучившихся лиц с разной степенью тяжести ОЛБ. Точки – индивидуальные данные, сплошные линии – регрессионные зависимости (табл. 4). Пунктирная линия - соответствующий спонтанный уровень.

Таблица 5. Коэффициенты регрессионной зависимости от времени частоты аномальных моноцентриков (АМ) в лимфоцитах крови облучившихся лиц

Данные Параметры динамики АМ

Y0±SE Y1±SE T4±SE

ОЛБ-I (32 чел, 62 точки) 2,29±0,30 0,46±0,06 3,04±1,02

ОЛБ-II (16 чел, 77 точек) 5,57±0,65 1,38±0,85 9,9±6,3

ОЛБ-III (7 чел, 55 точек) 8,57±1,34 4,29±2,0 10,7±15,6

ОЛБ-IV (1 чел, 11 точек) - - -

В подгруппе с ОЛБ–I существенное превышение спонтанного уровня наблюдается только в первые 10 лет после облучения. Сопоставление регрессионных зависимостей частоты транслокаций и АМ показало, что в остром периоде частота АМ составляла 10–12% от уровня транслокаций в группах ОЛБ–I, ОЛБ–II и 5% в группе ОЛБ–III. В отдаленном периоде это соотношение составило в среднем 18% по всем подгруппам.

Таким образом, динамика частоты стабильных аберраций в виде транслокаций и АМ была проанализирована в период до 45 лет после облучения. Показано, что после первых 10 лет частота индуцированных транслокаций падает до 12–18 % от первоначального уровня, оставаясь затем неизменной вплоть до 45–50 лет. Похожие закономерности были выявлены и для АМ, частота которых была примерно в 10 раз меньше, чем частота транслокаций. В целом наблюдалась очевидная корреляция степени тяжести ОЛБ облучившихся лиц с динамикой стабильных аберраций, но она была менее четкой, чем с частотой дицентриков в острый период (рис. 11).

Основной причиной снижения частоты стабильных аберраций в первые годы после облучения является элиминация нестабильных клеток. Как показано выше, элиминация основной доли нестабильных клеток происходит достаточно быстро, за время порядка 0,5/1,6 лет, в то время как снижение частоты стабильных аберраций за такое время наблюдалось только у лиц с дозой на все тело свыше 4 Гр (ОЛБ III–IV), а при меньших дозах частота стабильных аберраций снижалась гораздо медленнее, за 6/8 лет. Это означает, что при дозах на все тело менее 4 Гр (ОЛБ I–II) в течение первых 6/8 лет, наряду с элиминацией лимфоцитов, содержащих стабильные аберрации, идет процесс поступления таких клеток в периферическую кровь за счет процесса пролиферации из облученных стволовых клеток. С течением времени, когда элиминируют все первично облученные лимфоциты, поступление клеток, содержащих транслокации. стабилизируется, приводя к независящей от времени частоте транслокаций в лимфоцитах периферической крови.

Совершенствование методов биологической дозиметрии по цитогенетическим показателям.

Сочетание свойств лимфоцитов крови человека и метода их культивирования явилось основой т.н. «золотого стандарта» биодозиметрии, IAEA (2001). При этом соотношение индуцированного и спонтанного уровней аберраций (радиационных маркеров) определяет пределы применимости цитогенетического метода, Alexander G.A. et al. (2007). Для биодозиметрии в остром периоде используют дицентрики, центрические кольца, транслокации, а также ацентрические парные фрагменты, IAEA (2001). Для ретроспективной биодозиметрии в отдаленном периоде рассматриваются полные и неполные транслокации, выявляемые методом FISH. Ключевой проблемой при этом остается выбор калибровочной кривой для вычисления дозы по частоте транслокаций, выявляемых в отдаленном периоде. Точность биодозиметрии на основе транслокаций во многом зависит от погрешности при оценке линейного коэффициента дозовой зависимости и корректного учета спонтанного уровня аберраций, Simon S. et al. (2007).

Рис. 12. Изменение относительной частоты дицентриков (A) и величины Qdr (Б) с течением времени после облучения. Точки - индивидуальные показатели (11 чел., 111 точек), сплошные линии – регрессионные зависимости, пунктир 95% доверительный интервал. Регрессионные формулы-

Y=0.84 exp(-t/0.74) + 0.16 exp(-t/7.6))

Y = 0.545 + 0.455 exp(-t/0.79))

В настоящей работе был исследован фактор индивидуальной радиацион-ной чувствительности человека для уточнении области применимости известных методов на основе нестабильных аберраций для ретроспективной дозиметрии. Для этого был выполнен анализ динамики частоты дицентриков и величины Qdr (число дицентриков и центрических колец на аберрантную клетку) у облучившихся лиц. На рис. 12 показаны относительная частота дицентриков и величина Qdr в зависимости от времени после облучения. По ординате отложены зависимости отношения этих величин на время t к показателю, который был получен у того же человека сразу после облучения.

В результате установлено, что уже через год после облучения частота дицентриков и величина Qdr снижаются в среднем на 65% и 35%, соответственно. Такое изменение указывает на неприемлемость этих показателей для ретроспективной биологической дозиметрии. Очевидно, что допустимый временной интервал между облучением и взятием образцов крови может составлять не более 4 месяцев. Из представленных данных следует, что средняя величина Qdr вначале снижается, но по истечении примерно 5 лет выходит на плато, которое проявляется статистически достоверно в пределах 95% интервалов (рис.12). Чтобы изменение величины Qdr с течением времени не искажало оценку дозы, необходимо вносить повышающую поправку в этот показатель, если он получен в период свыше 5 мес. после облучения. Такая поправка составляет от 30% до 50% при взятии образцов крови на анализ в период от 1 года до 10 лет после облучения, соответственно (рис.12).

Для уточнения применимости метода транслокаций в ретроспективной биологической дозиметрии были использованы результаты анализа динамики частоты индуцированных транслокаций в отдаленном пострадиационном периоде. Как известно, индуцированные и наблюдаемые транслокации различаются за счет зависящей от возраста человека частоты спонтанных аберраций. Так, анализ индуцированной компоненты показал снижение частоты транслокаций за первые 5 лет после облучения до постоянного уровня, который существенно не менялся в течение 30 лет. Этот постоянный уровень зависел от поглощенной дозы на все тело и снижался по отношению к начальному значению до 43% при дозах менее 4,7 Гр и до 23% для бoльших доз. Характерное время снижения частоты индуцированных транслокаций зависело от дозы, убывая с 4,4 до 1,4 (лет) с ростом дозы от 1 до 7 Гр.

Оцененные параметры динамики частоты индуцированных транслокаций позволяют предложить способ корректировки калибровочной дозовой зависимости. Необходимость корректировки калибровочной in vitro дозовой зависимости, с целью использования частоты транслокаций для ретроспектив-ной биодозиметрии, является актуальной научной задачей, Duran A. et al. (2009). В настоящей работе предложен метод корректировки, основанный на обобщении индивидуальных цитогенетических данных облучившихся лиц, у которых брались образцы крови как в ранний, так и в отдаленный периоды. Начальная частота дицентриков позволила вычислить поглощенную дозу, а прослеженная в пострадиационном периоде динамика частоты транслокаций - внести поправки в in vitro калибровочную зависимость для корректного вычисления дозы по частоте транслокаций, выявляемых в отдаленном периоде.

В качестве калибровочной зависимости на начальное время (острый период, t=0, рис. 13) была использована in vitro дозовая зависимость суммы полных и неполных индуцированных транслокаций, которая была получена в настоящей работе путем вычитания из наблюдаемой в эксперименте частоты транслокаций соответствующего возрастного контроля. Калибровочные дозо-вые зависимости на время t>0 были получены с использованием динамики индуцированных транслокаций в соответствующих дозовых группах. За счет внесения подобных поправок в in vitro калибровочную кривую предложен способ устранить смещенную оценку при вычислении дозы, которая приводит к существенному занижению индивидуальных поглощенных доз (рис.13).

Следует отметить, что в литературе предлагаются альтернативные методы корректировки. Так, в работах Finnon P. et al. (1999), Edwards A.A. et al. (2005), Simon S.L. et al. (2007) предложен метод построения дозовой зависимости путем подсчете транслокаций только в стабильных клетках. Предполагается, что стабильные клетки свободно проходят цикл деления и поддерживают частоту индуцированных в них транслокаций на постоянном уровне. Данная гипотеза правомерна с теоретической точки зрения, однако не получила статистически представительного подтверждения на данных in vivo. Тем не менее, предложенный метод успешно применяется на практике при оценке доз облучения менее 3 Гр, Lloyd D.C. et al. (1998), Edwards A.A. (2007).

Рис. 13. Калибровочные дозовые зависимости частоты индуцированных транслокаций (tc+ti)/100GE кл для ретроспективной биологической дозиметрии с учетом поправки на время после облучения.


загрузка...