Стимуляция ангио/миогенеза при сердечно-сосудистой патологии с использованием генной терапии и аутотрансплантации клеток-предшественников (30.11.2009)

Автор: Еремеева Марина Викторовна

В отличие от показателя ОЗ жизнеспособность (ЖС), сравнима с нормальным значением, а через 6 месяцев в 1-ой группе – превышает его (p<0,05), что объясняется значительным улучшением эмоционального настроя пациентов на фоне улучшения физического состояния. То же можно сказать и о психическом здоровье (ПЗ) пациентов. При исходно значительно сниженном ПЗ у пациентов 1-ой группы по сравнению с нормальным значением (p<0,05), уже в течении первого месяца эмоциональная картина меняется – ПЗ стремится к нормальному. Показатель РПП (влияния эмоционального состояния на жизнедеятельность) достоверно увеличивается у пациентов 2-й группы через 1 месяц, у пациентов 1-й группы – через 3 месяца. Социальная активность ожидаемо возростает, достоверно не отличаясь от нормального значения. Часть пациентов (6 человек – 24 %) изменили планы на будущее: трое снова начали, а трое продолжили работать после длительного перерыва.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Значительное число больных ИБС (от 5 до 21% по разным оценкам) имеют противопоказания к реваскуляризации хирургическими и интервенционными методами, либо у них таким способом не удается достичь полной реваскуляризации (de Feyter P., 1992; Mukherjee D. и соавт., 1999) и снять симптоматику стенокардии. В такой ситуации целесообразно рассматривать возможность применения терапевтического ангиогенеза, позволяющего обеспечить полноценный кровоток путем стимуляции формирования новых сосудов (Laham R. и соавт., 2000). Аналогичным образом, заметное количество больных хронической ишемией нижних конечностей (до 5%) страдают от остаточных симптомов после хирургии и традиционной терапии (Baumgartner I. и соавт., 2000). Несомненно, в этой группе больных терапевтический ангиогенез выглядит перспективным дополнением хирургического лечения. Более того, тяжелая сердечная недостаточность – прогрессирующий синдром, характеризующийся необратимой утратой миоцитов, теоретически может быть компенсирован за счет стимуляции регенерации миоцитов, т.е. миогенеза.

Первый этап нашего исследования был посвящен созданию генетической конструкции для терапевтической стимуляции ангиогенеза у нуждающихся в этом больных. В качестве преспективных генов-кандидатов были выбраны VEGF165 и bFGF. Полученные на основе pBK-CMV генетические конструкции эффективно воспроизводятся в культуре E. coli, и с высокой степенью чистоты могут быть выделены из клеточного лизата на колонках фирмы Qiagen. Созданная таким образом конструкция позволяет относительно легко нарабатывать значительные (15 – 50 мг за один цикл выделения) количества плазмидной ДНК, пригодной для введения больным. Мы остановились на плазмидной конструкции в качестве стимулятора ангиогенеза основываясь, во-первых, на относительной дешевизне и простоте получения значительного количества препарата, во-вторых, на данных об эффективной экспрессии плазмидной ДНК в мышечной ткани (Tripathy и соавт., 1996), и, в-третьих, из-за опасения осложнений, связанных с применением у больных вирусного вектора (Marshall и соавт., 2003). Последующее исследование токсичности и переносимости препаратов подтвердили безопасность их применения в эксперименте на животных, и в перспективе – для лечения больных. Первично эффективность препарата VEGF165 была проверена в стандартном тесте с матригелем. Продемонстрирована экспрессия кодируемого плазмидой белка VEGF165 в человеческих клетках НЕК 293, а имплантация крысе помещенных в матригель трансфецированных плазмидой клеток приводила к эффективной стимуляции процессов ангиогенеза в коже.

Следующим этапом нашего исследования стала проверка эффективности сконструированных препаратов на модели хронической ишемии скелетной мышцы задней конечности крысы. Сравнительное изучение эффективности двух генетических конструкций показало, что через 30 дней после введения в зону ишемии даже минимальной из использованных нами в эксперименте доз (250 мкг/животное) VEGF165 отмечается достоверное по сравнению с контролем увеличение плотности капиллярного русла, в то время как введение даже максимальной в рамках данного исследования дозы bFGF (750 мкг/животное) не оказывает существенного влияния на кровоток в ишемизированной конечности. Ангиогенная эффективность белковых препаратов FGF была продемонстрирована в ряде экспериментов на животных, как при локальном, так и при интракоронарном способах введения (Lazarous D. и соавт., 2000; Rajanayagam M. и соавт., 2000). В то же время результаты клинических испытаний белковых и генетических препаратов FGF далеко не так однозначны (Ruel M. и соавт., 2002; Simons M. и соавт., 2002). На данном этапе наших исследований, мы решили сосредоточиться на клинических испытаниях содержащей VEGF165 плазмиды (препарат «Ангиостимулин»).

Поскольку ишемия органа приводит, в том числе к истощению регенеративных возможностей за счет уменьшения числа резидентных стволовых клеток, введения ангиогенных факторов может оказаться недостаточно для полноценного восстановления функции органа. В этой связи привлекательной альтернативой выглядит использование стволовых плюрипотентных клеток. Эндотелиальные клетки-предшественники (ЭКП) представляют собой гетерогенную группу клеток, характеризуемую экспрессией ряда поверхностных маркеров, таких как CD34, CD133 и VEGFR-2 (KDR или Flk-1), способностью накапливать DiI-Ac-LDL и связывать считающиеся специфичными для эндотелия лектины, такие как Ulex europaeus. Маркер стволовых клеток CD34 в меньшем количестве выявляется также на зрелых клетках эндотелия, и поиск более специфичных маркеров привел к обнаружению CD133, с высокой плотностью экспрессируемого на незрелых стволовых клетках, и утрачиваемого в процессе дифференцировки (Handgretinger R. и соавт., 2003). Предполагается, что в популяции ЭПК наличествуют две субпопуляции: более примитивная CD133+/CD34-/VEGFR-2+ и более зрелая CD133+/CD34+/VEGFR-2+. Нашей задачей было более подробно исследовать субпопуляционный состав ЭПК, а также фенотипически и функционально охарактеризовать эти клетки в условиях in vitro и in vivo.

Использованный в нашей работе способ выделения позволяет с высокой эффективностью получать очищенный препарат аутологичных стволовых клеток пациента. На выходе с колонки мы получали 1-3 миллиона стволовых клеток.

Анализ поверхностного фенотипа выделяемых клеток позволил продемонстрировать наличие в костном мозге обследованных пациентов CD133+/CD34- субпопуляции стволовых клеток, которые в дальнейшем дифференцируются в субпопуляцию, экспрессирующую CD133+/CD34+, и в ходе последующей дифференцировки в соответствующих условиях in vitro приобретают фенотип зрелых эндотелиальных клеток. В то же время, эта субпопуляция CD133+/CD34- ЭКП функционально оказалась более активной, чем теоретически более зрелая субпопуляция ЭКП CD133+/CD34+. В условиях in vitro эта субпопуляция клеток-предшественников после обработки SDF-1 более активно прилипает к обработанной фибронектином поверхности и более эффективно дифференцируется в зрелые эндотелиальные клетки по сравнению с субпопуляцией CD133+/CD34+ клеток.

Со времени первого сообщения в научной литературе (Asahara T. и соавт., 1997) было принято считать, что фенотип ЭКП определяется экспрессией на поверхности маркеров CD34 и VEGFR-2. В дальнейшем, обнаружение маркера стволовых клеток CD133 (Peichev M. et al., 2002), экспрессия которого, в отличие от CD34 утрачивается по мере дифференцировки ЭКП в клетки эндотелия, позволило подразделить популяцию ЭКП на субпопуляцию CD133+/CD34+/VEGFR-2+, предположительно состоящую из более ранних клеток-предшественников, и субпопуляцию CD133-/CD34+/VEGFR-2+ клеток, предположительно далее продвинувшуюся по пути дифференцировки эндотелиального ростка (Peichev M. c соавт.). Полученные нами данные указывают на вероятность существования третьей, потенциально более примитивной субпопуляции ЭКП, определяемой экспрессией на поверхности CD133 и VEGFR-2 при отсутствии экспрессии CD34. Этот вывод подкрепляется результатами, полученными Guo Y. и соавт. В своей работе они показали, что в процессе культивирования in vitro CD34-отрицательные стволовые клетки, выделенные из костного мозга мышей, приобретают способность экспрессировать CD34, т.е. CD34- стволовые клетки могут быть предшественниками CD34+ клеток. Аналогичным образом, в нашем исследовании CD133+/CD34- ЭКП из костного мозга человека дифференцировались в CD133+/CD34+ клетки при культивировании in vitro в условиях, способствующих дифференцировке в эндотелиальные клетки. Описанная нами субпопуляция CD133+/CD34- ЭКП отличается от субпопуляции ЭКП, описанной Rehman и соавторами, поскольку последнюю характеризует высокий уровень экспрессии CD14 (95,7%) и низкий уровень экспрессии CD133 (0,16%) на поверхности клеток, в то время как исследованные нами CD133+/CD34- не экспрессируют CD14. Kuci S. и соавторы (Hangretinger R. и соавт., 2003) показали, что получаемая при культивировании in vitro мононуклеаров человеческой крови в присутствии Flt3/Flk2 лиганда и интерлейкина-6 субпопуляция стволовых CD133+ клеток не экспрессирует CD34 и обладает способностью репопулировать костный мозг мышей с двойной мутацией: тяжелым комбинированным иммунодефицитом и диабетом I-го типа. После трансплантации эти клетки приживались на значительно более длительное время, чем свежевыделенные CD34+ клетки. Кроме того, на ограниченном контингенте больных (6 пациентов) было показано, что трансплантация CD133+ клеток ведет к улучшению функционирования миокарда в постинфарктный период (Stamm C. et al.,2003). Наблюдение за пересаженными бестимусным мышам CD133+ клетками-предшественниками из пуповинной крови человека показало, что они участвуют в формировании капиллярной сети в ишемизированной задней конечности, стимулируют процессы неоваскуляризации и способствуют восстановлению ишемизированых тканей задней конечности. Тем не менее, конкретные механизмы, опосредующие миграцию стволовых клеток в ишемизированные ткани, а также регуляция и механизм регенеративного действия CD133+ стволовых клеток требуют дальнейшего, более углубленного экспериментального исследования.

Хотелось бы подчеркнуть, что по нашему мнению, субпопуляция CD133+/CD34-/VEGFR-2+ ЭКП костномозгового происхождения играет ключевую роль в регенерации эндотелия и восстановлении поврежденных тканей. Учитывая их высокую регенеративную способность, представляется рациональной трансплантация таких клеток в терапевтических целях. По результатам наших экспериментов, мы предполагаем, что субпопуляция CD133+/CD34-/VEGFR-2+ клеток содержит предшественники CD133+/CD34+/VEGFR-2+ клеток и обладает более высоким по сравнению с последними потенциалом восстановления сосудистого русла. Полученные нами данные расширяют современные представления о гетерогенности популяций ЭКП и могут иметь значение для лечения ишемической болезни сердца и патологии магистральных сосудов.

При ИБС в основе всех патологических процессов лежит, как правило, постепенное прогрессирование артериальной недостаточности с нарушением периферической макрогемодинамики в результате развития стенотических и облитерирующих процессов в артериях. Прежде всего, это касается микроциркуляторных расстройств, которые развиваются вторично из-за низкого перфузионного давления (Савельев В.С. и соавт., 1997). Отмечается поражение капилляров, питающих мышечные волокна конечностей, дегенеративные изменения эндотелия в них и агрегация форменных элементов крови. Поэтому клиника тяжелой ишемии определяется как микроциркуляторными нарушениями, так и изменениями гемореологическими. Несостоятельность капиллярного кровообращения является одним из ведущих факторов в развитии грубых трофических нарушений у пациентов с декомпенсацией каппилярного кровотока (Казаков Ю.И. и соавт., 1997). Следует отметить, что даже при идеально выполненной операции микроциркуляция в конечности не нормализуется в течение 2-3 лет после операции и ухудшается из-за продолжающегося прогрессирования основного патологического процесса. Поэтому все пациенты после операции нуждаются в продолжении консервативной терапии, независимо от исхода хирургического лечения (в том числе по причине сопутствующего поражения других артериальных бассейнов). Больным же с неоперабельным поражением дистального артериального русла нижних конечностей, слабым развитием коллатеральных путей кровотока и, соответственно, минимальным клиническим улучшением и при отсутствии динамики после операции (по результатам нашего исследования всего в 15 % случаев) помимо принятого объёма консервативной терапии требуется более интенсивное воздействие на коллатеральное русло глубокой бедренной и подколенной артерий.

При клиническом применении генных технологий (плазмидной конструкции VEGF165) для лечения хронической критической ишемии нижних конечностей (терапевтическая доза препарата составляет 1000 мкг (Isner J. И соавт., 1999) различной этиологии (атеросклероз и облитерирующий тромбангиит) по данным литературы уже через 1 месяц после введения препарата получен статистически достоверный положительный результат. Максимальный терапевтический эффект отмечен к третьему месяцу. Сходная динамика установлена и нами. У большей части пациентов (до 71 %) полностью прекратились или уменьшились боли покоя (до 86 % по данным литературы), у 4 из 5 пациентов зажили или значительно уменьшились трофические язвы (57-67 % по данным литературы), на 10,4-13 мм рт.ст. увеличилось транскутанное напряжение кислорода, показатели перфузии конечности по данным лазерной допплеровской флоуметрии, в среднем на 0,1 – индекс лодыжечного давления (по данным литературы на 0,15-0,19), на 1,88 минуты – длительности безболевой ходьбы (на 1,3 минуты по данным литературы); возросло количество новообразовавшихся видимых коллатеральных сосудов на уровне колена, голени и стопы по данным ангиографического исследования – средний прирост составил +2,0+/-0,45 (по разным данным литературы в среднем +1,3+/-0,04). В той или иной степени к 3 месяцу клиническое улучшение отмечается у всех пациентов (90% пациентов по данным литературы), при этом умеренное улучшение по шкале Рутерфорда – в 57 % случаев (50% по данным литературы (Baumgartner I. и соавт., 1998).

Активизация восстановительных процессов в ишемизированных тканях достигается путем индукции в них процессов ангио/миогенеза, которые могут быть усилены применением ангиогенезстимулирующих факторов.

Созданная плазмидная конструкция ангиогенного препарата – ангиостимулин - биосовместима, нетоксична, позволяет эффективно экспрессировать ген VEGF165, и может быть использована для индукции репаративного ангиогенеза в ишемизированных тканях.

Высокоочищенная популяция CD133+ стволовых клеток костного мозга состоит из двух субпопуляций: менее зрелых CD133+/CD34-/VEGFR-2+ клеток и более дифференцированных CD133+/CD34+/VEGFR-2+ клеток, причем субпопуляция CD133+/CD34-/VEGFR-2+ клеток обладает более высоким потенциалом дифференцировки в направлении неоангиогенеза.

Клетки CD133+ обладают более выраженной ангиогенной активностью по сравнению с CD34+, и поэтому именно эти клетки должны использоваться для стимуляции ангиогенеза при лечении ишемической болезни сердца и хронической ишемии нижних конечностей.

Препарат «ангиостимулин» улучшает перфузию миокарда в наиболее пораженных ишемией сегментах и этот эффект сохраняется не менее года.

При сравнительной оценке эффективности способов введения аутологичных костномозговых клеток-предшественников CD133+ для стимуляции регенеративных процессов в миокарде, показано что при интрамиокардиальном введении отмечается достоверное улучшение перфузии в леченных сегментах с исходно умеренным и значительным снижением перфузии. При интракоронарном способе введения достоверных изменений показателей перфузии получено не было.

Как при артериальном, так и при внутримышечном введении аутологичных клеток-предшественников CD133+ или гена VEGF165 зарегистрировано образование новой сосудистой сети при лечении ХИНК.

После аутотрансплантации клеток-предшественников CD133+ достоверно улучшалось качество жизни больных ИБС и ХИНК.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

Исходя из результатов проведенных исследований представляется целесообразным

применение внутримышечного введения генного препарата VEGF165 (ангиостимулина) при ишемии миокарда и хронической ишемии нижних конечностей (с учетом критериев включения и исключения пациентов).

Использование аутологичных костномозговых клеток-предшественников CD133+ можно рекомендовать для лечения сердечной недостаточности в сочетании с хирургическими методами, при этом наиболее эффективным является метод изолированного интрамиокардиального введения.

При лечении ХИНК можно рекомендовать как внутриартериальное, так и внутримышечное введение аутологичных клеток-предшественников CD133+ или ангиостимулина (гена VEGF165).

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Бокерия Л.А., Еремеева М.В.Современное состояние и перспективы использования ангиогенеза в лечении ишемической болезни сердца. Грудная и сердечно-сосудистая хирургия, 2000, №2, 57-61.

Еремеева М. В., Голухова Е.З. Факторы ангиогенеза при ишемии. Стимуляция неоангиогенеза в миокарде. Лекции по кардиологии, в 3-х томах, под ред. Бокерия Л.А. и Голуховой Е.З., изд. НЦССХ им. А.Н.Бакулева, Москва, 2001, с.161-170.

Бокерия Л.А., Голухова Е.З., Еремеева М. В., Киселев С.Л. Стимуляция неоангиогенеза при ишемии миокарда. Первый этап доклинических испытаний плазмидной ДНК VEGF. Пятая ежегодная сессия Научного Центра сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева. Бюллетень НЦССХ им Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». 2001, №3, стр. 136.

Бокерия Л.А., Еремеева М.В., Э.С. Полякова. Разработка клинико-диагностических критериев отбора больных ИБС для применения терапевтического ангиогенеза. Седьмой всероссийский съезд сердечно-сосудистых хирургов. Бюллетень НЦССХ им Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». 2001, №3, стр.231.

Бокерия Л.А., Еремеева М.В., Полякова Э.С., Серов Р.А. Про- и антиангиогенные факторы при ишемической болезни сердца в зависимости от степени выраженности атеросклероза. VI ежегодная сессия НЦССХ им. А.Н. Бакулева с Всероссийской конференцией молодых ученых. Бюллетень НЦССХ им Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». 2002, №3, стр.161.

. Eremeeva M., Golukhova E., Alshibaya M., Berishvili I., Bockeria L. Angiogenic factors production stimulated by different methods of myocardial revascularisation. 8-th International Local Drug Delivery meeting and cardiovascular course on Radiation and molecular strategies, Geneva, Switzerland, 2002, p.18.

Eremeeva M.V., Golukhova E.Z., Bockeria L.A. Endogenous angiogenesis activation in ischemic heart disease patients: different methods of myocardial revascularization of strategies for therapeutic angiogenesis. In book “Angiogenesis bench to bedside”, 2003, Medical and Engineering Publishers Inc., pp.275-292.

Л.А. Бокерия, М.В. Еремеева, Э.С. Полякова, Т.Т. Какучая, М.А. Лукашкин. Прогностическая значимость определения уровня pro-ANP и pro-BNP для оценки степени сердечной недостаточности и эффективности терапевтического ангиогенеза. VII ежегодная сессия НЦССХ им. А.Н. Бакулева с Всероссийской конференцией молодых ученых. Бюллетень НЦССХ им Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». 2003, №3, стр.161.

Л.А.Бокерия, Е.З.Голухова, И.П.Асланиди, М.В.Еремеева, В.Ю.Мерзляков, И.И.Беришвили, А.Ф.Клюева, Т.Т. Какучая, Э.С. Полякова, М.А.Лукашкин. Экспериментальное и клиническое исследование препаратов на основе генов ангиогенных факторов (VEGF и bFGF человека) при ишемии. VII ежегодная сессия НЦССХ им. А.Н. Бакулева с Всероссийской конференции молодых ученых. Бюллетень НЦССХ им Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». 2003, стр.161.

Eremeeva M., Bockeria L., Golukhova E., Kiselev S.L., Polyakova E., Lukashkin M. A. Different methods of revascularization combined with intramyocardial VEGF gene transfer administration in IHD patients. International Journal of Medical Implants and Devices, Vol. l, No l, 2003 Medical and Engineering Publishers, Inc, USA, pp 100-155.

Eremeeva M., Bockeria L., Golukhova E., Kiselev S.L., Polyakova E., Lukashkin M. A. Intramyocardial VEGF gene administration in IHD patients during different methods of surgical revascularisation. Angiogenesis: Novel basic science insights and human therapy. Keystone symposia 2004 abstract book, p.12.

Л.А.Бокерия, М.В.Еремеева, Э.С.Полякова. Диагностика сердечной недостаточности с помощью определения концентраций предшественников натрийуретических пептидов в плазме крови больных ИБС. Девятый всероссийский съезд сердечно-сосудистых хирургов. Бюллетень НЦССХ им Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». Москва. Ноябрь 2003, стр.326.

Бокерия Л.А., Голухова Е.З., Асланиди И.П., Еремеева М.В., Мерзляков В.Ю., Беришвили И.И., Клюева А.Ф., Какучая Т.Т., Полякова Э. С., Лукашкин М.А. Первые результаты клинического применения терапевтического ангиогенеза с использованием гена VEGF165 человека. Девятый всероссийский съезд сердечно-сосудистых хирургов. Бюллетень НЦССХ им Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». 2003, № 11, стр.326.

Бокерия Л.А., Голухова Е.З., Еремеева М.В., Полякова Э.С. Использование предшественников натрийуретических пептидов в диагностике сердечной недостаточности ишемической этиологии до и после операции аортокоронарного шунтирования. Бюллетень НЦССХ им Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания. Креативная кардиология. Новые технологии в диагностике и лечении заболеваний сердца» 2004, т. 5, № 3, стр.156-161.


загрузка...