Стимуляция ангио/миогенеза при сердечно-сосудистой патологии с использованием генной терапии и аутотрансплантации клеток-предшественников (30.11.2009)

Автор: Еремеева Марина Викторовна

Материалы работы могут быть рекомендованы к применению в научно-педагогической деятельности кардиохирургических центров нашей страны, в которых осуществляется квалификационная подготовка специалистов, работающих в кардиологии и кардиохирургии.

Результаты данной работы внедрены в клиническую практику Научного Центра Сердечно-Сосудистой Хирургии им. А.Н.Бакулева РАМН, а также материалы диссертации используются в курсе лекций для аспирантов и ординаторов, в сертификационном курсе для сердечно-сосудистых хирургов, проходящих обучение на базе НЦССХ им. А.Н.Бакулева РАМН.

Положения, выносимые на защиту:

Дополнительная стимуляция процессов ангио/миогенеза в ишемизированных тканях ведет к улучшению прогноза течения заболевания и улучшению качества жизни больных ишемической болезнью сердца и хронической ишемией нижних конечностей.

Применение плазмидной генетической конструкции (ангиостимулин) безопасно для больного, позволяет эффективно экспрессировать ген VEGF165, и может быть использована для индукции репаративного ангиогенеза в ишемизированных тканях.

Популяция стволовых CD133+/CD34-/VEGFR-2+ клеток-предшественников обладает большим дифференцировочным потенциалом в направлении неоангиогенеза по сравнению с CD133+/CD34+/VEGFR-2+ клетками, что обусловливает их большую терапевтическую эффективность.

Терапевтическая эффективность аутотрансплантации стволовых CD133+ клеток определяется в том числе способом введения. В то время как интра-миокардиальный способ достоверно улучшает перфузию ишемизированного миокарда, интракоронарное введение не оказывает влияния на данный параметр.

Апробация диссертации состоялась 8 мая 2009 года на заседании апробационного совета НЦССХ им. А.Н.Бакулева РАМН.

Публикации. По теме работы опубликовано 43 научные работы, из них 16 – в центральной (в том числе зарубежной) печати объемом более 100 страниц.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 186 страницах, состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, характеристика материалов и методов исследования, результаты, обсуждение), выводов, практических рекомендаций и указателя литературы из 6 отечественных и 323 зарубежных источников. Диссертация содержит 40 таблиц и 70 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Методы экспериментальных исследований.

Гистологическая оценка экспрессии факторов ангиогенеза и рецепторов к ним. Для окраски срезов тканей миокарда использовали моноклональные антитела: анти- CD34 Dako Corp., Дания; анти-CD31 Dako Corp., Дания; анти-VEGF Santa Cruz Bio-tech., U.S.A.; анти- Flt-1 Santa Cruz Bio-tech, U.S.A.; анти-Flk-1 Santa Cruz Bio-tech, U.S.A.; анти-Thrombospondin Boerhinger Manhiem, Германия; анти-CD95, анти-CD95L Novocastra. Биопсийный материал ишемизированного участка миокарда размером не менее 5*3 мм забирали во время операции КШ. Материал немедленно помещали в 10% раствор нейтрального формалина. Проводка и заливка биопсийного материала в парафин проводилась по стандартной методике. Выдержка в 10% нейтральном формалине не превышала 24-36 часов. Для оценки экспрессии факторов ангиогенеза и других факторов роста использовались срезы толщиной 4мкм. Срезы депарафинировали и дегидратировали по стандартной методике. Для восстановления структуры антигенов срезы обрабатывались в Target Retrieval Solution (Dako) на водяной бане в течение 30 мин при 95-990С. Для блокирования эндогенной пероксидазы и неспецифического связывания срезы инкубировали с 3% Н2О2, 15 мин, а затем с 1% БСА - 15 мин при комнатной температуре. Инкубацию с первичными антителами проводили от 30 до 60 мин (в зависимости от вида антител) при комнатной температуре. После инкубации срезы промывали в PBS. Визуализация первичных антител производилась с помощью системы 4SAB plus kt (Dako Corp.) согласно инструкции. Препараты докрашивали гематоксилином и заключали в бальзам. Подсчет количества сосудов проводился в поле зрения микроскопа при увеличении х200-х250.

Электронная микроскопия интраоперационной биопсии миокарда зоны, расположенной рядом с постинфарктной аневризмой левого желудочка. У 16 больных с постинфарктной аневризмой ЛЖ были взяты интраоперационные биопсии миокарда ЛЖ из зоны, расположенной рядом с постинфарктной аневризмой левого желудочка. Биопсийный материал фиксировали в растворе 2,5% глютарового альдегида и 1% параформальдегида на фосфатном буфере (рН 7,4), дофиксировали в 1,5% растворе четырехокиси осмия, обезвоживали, заливали в аралдит. На ультратоме Leica изготавливали полутонкие и ультратонкие срезы. Полутонкие срезы ткани окрашивали по методу ШИК с докраской метиленовым синим, изучали под световым микроскопом. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца, просматривали в электронном микроскопе Philips CM100.

Получение плазмидной конструкции, содержащей ген васкулоэндотелиального фактора роста VEGF165 (ангиостимулин). Последовательность человеческого гена VEGF была получена из базы данных Genom Database c помощью программы Entrez (NM003376). Для получения гена к его последовательности были синтезированы праймеры: к 5' концу гена TGO GGC CGA AAC CAT GA и CGG CTC ACC GCC TCG GCT T к 3' концу гена. Праймер к 5' концу гена был выбран с учетом последовательности Козак, обеспечивающей эффективное начало трансляции. Для обеспечения возможности проверки экзогенного белкового продукта гена VEGF был также синтезирован праймер на 3' конец гена, который помимо последовательности гена содержал эпитоп распознавания антителами полигистидиновой последовательности, необходимой для последующей очистки белка. Для удобства клонирования и анализа праймеры также включали сайты узнавания уникальными рестриктазами, не содержащимися в последовательности гена. Сайт Eco RI для 5' концевого праймера и Smal сайт для 3' концевого праймера. Фрагменты ДНК, соответствующие по размерам VEGF165 и VEGF121, элюировались из геля после рестрикции и очищались с помощью набора фирмы Qiagen. Конструкция, содержащая ген VEGF165, была изготовлена на основе вектора pBK-CMV neo (Stratagene). Полученные плазмиды встраивали в соответствующий штамм Escherichia coli с целью наработки белка в процессе ферментации с последующей очисткой препарата из клеточного лизата на аффинных колонках с антителами, специфичными к гистидиновому хвосту молекулы.

Исследование эффективности ангиостимулина in vivo в тесте с матригелем. В экспериментах использовали мышей-самок С57Bl/6 возрастом 6-8 недель. Матригель (BD Bioscience, Discovery Labware) при 40С смешивали со 100 нг/мл VEGF (Becton Dickinson Labware), либо с клетками, трансфецированными геном VEGF165. Смесь Матригеля затем вводили подкожно мышам в подмышечную впадину, где он полимеризовался с формированием имплантанта, который удаляли на 7 день, фиксировали в 10% нейтральном формалине в течение 24-36 часов и заключали в парафин. Срезы толщиной 4-5 мкм докрашивались гематоксилин-эозином и по Мейсону (Masson’s trichrome, Sigma Diagnostic). Общий индекс клеточной инвазии определялся при анализе изображений срезов, полученных с помощью цифровой камеры. Количество мигрировавших клеток определялось подсчетом процента области, занятой эндотелиальными клетками к общей области Матригеля.

Исследование эффективности ангиостимулина на модели ишемии нижних конечностей. В эксперименте использовались крысы Vistar, взрослые особи массой 200-250 грамм обоего пола. Для изучения ангиогенного эффекта испытываемых препаратов была создана модель хронической ишемии скелетной мышцы конечности крысы. Под внутрибрюшинным наркозом раствором тиопентала производилась перевязка бедренной артерии крысы нитью Prolen на двух уровнях – проксимальном и дистальном. На 10-е сутки после перевязки артерии из области ишемии брался кусочек ткани для гистологического исследования, вводился ген ангиогенного фактора в различных дозах. На 30-е сутки после введения препарата брался на гистологический анализ кусочек ткани из места инъекции. Блоки ткани скелетной мышцы замораживали при помощи охлажденного до -800С петролейного эфира. Срезы толщиной 10 мкм приготавливали в криостате Leica. Свежезамороженные срезы скелетной мышцы окрашивали гематоксилином и эозином по Ван-Гизон, выявляли активность сукцинатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы. Активность ферментов определяли по методике Burstone M.S., регистрируя восстановление соли нитросинего тетразолия до синего диформазана.

Методика оценки эффективности препаратов по плотности капиллярной сети в ишемизированной ткани. Блоки ткани скелетной мышцы фиксировали в 4% нейтральном формалине и заливали в парафин. Парафиновые срезы скелетной мышцы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином по Ван-Гизон. Оценка плотности капиллярного русла проводилась при увеличении х1000 с использованием иммерсии. Подсчитывалось количество открытых капилляров при оценке не менее 10 полей зрения на срез. Сравнивались полученные данные от одного животного до введения препарата и через 30 дней после введения.

Метод выделения и получения аутологичных клеток-предшественников CD133+. Использовалась стандартная методика пункции костного мозга под местной анестезией из крыла подвздошной кости в количестве 40 мл. Пункция помещалась в 2х50 мл пробирки с 5 мл PBS и 200U/мл гепарина. Полученная масса разводилась 1:2 средой RPMI 1640, содержащей 0,02% коллагеназы B и 100U/мл ДНКзы. Осторожно перемешивалась при 200C 45 мин. После фильтрации через фильтр 40 мкм выделялся весь пул мононуклеаров методом центрифугирования (35 мин - 400g - 200 C) на градиенте плотности Ficoll. Выделенные мононуклеары двукратно отмывали в растворе PBS, содержащем 2mM EDTA, центрифугировали (10 мин -300g - 200C). Подсчитывали концентрацию мононуклеаров в камере Горяева. Оставляли финальный объем 300мкл PBS/не более 108 клеток для последующей магнитной сепарации CD133+. Для ингибирования неспецифического связывания добавляли FcR блокирующий реагент (100мкл). Инкубировали 10 мин при 200C. После чего сразу вносили антитела CD133 на микросферах (100мкл) и инкубировали 30 мин при 40C. После отмывки в 10х объеме раствора PBS (10 мин - 300g – 200С) ресуспендировали осадок в 500 мкл буфера. Для магнитной сепарации использовали MS колонки. После подсчета и оценки жизнеспособности клетки помещали в инкубатор (370С, 0,5% CO2) в бессывороточной среде X-VIVO 15 согласно рекомендациям GMP, где сохраняли в течение 1-2 суток до процедуры введения пациенту. Для введения CD133+ клетки-предшественники разводили в физиологическом растворе (2мл), содержащем 20% аутологичной сыворотки пациента.

Метод проточной цитофлюориметрии (FACS). Цитометрический анализ проводился с использованием программ MultiGraph и FlowJo.

Иммуноцитохимический анализ. Мононуклеары были выделены на градиенте фикола и в конценрации 4х106 помещены в 24-луночный планшет, предварительно покрытый человеческим фибронектином (10мкг/мл) (Sigma), в эндотелиальной основной среде EBM (CellSystems) c добавлением компонентов SingleQuots и 20% FCS. После культивирования (4 суток) были удалены неприкрепившиеся клетки и прикрепившиеся оставлены для цитохимического анализа.

Для анализа эндотелиального фенотипа выделенных клеток-предшественников использовали 1,1-dioctadecyl-3,3,39,39-tetramethylindocarbocyanine–labeled acetylated LDL (Dil-Ac-LDL)(CellSystems). Клетки инкубировали в среде с 2,4 мкг/мл Dil-Ac-LDL 60мин при 370С. После отмывки в PBS клетки фиксировали в 2% растворе формальдегида в PBS 10 мин при 200C в темноте. Затем клетки отмывали и инкубировали с FITC-меченным Ulex europaeus agglutinin I (Sigma) в течение 60мин в темноте. Клетки, позитивные и по Dil-Ac-LDL, и по лектину были идентифицированы как эндотелиальные клетки–предшественники (ЭКП) и подсчитаны в каждой лунке. Два независимых исследователя подсчитывали количество ЭКП в каждой лунке трижды в 6 полях зрения.

2. Материалы и методы исследования в клинике.

Общая характеристика больных. В клиническое исследование по оценке эффективности стимуляции ангиогенеза при применении генного препарата «ангиостимулин» и фракции клеток CD133+ было включено всего 101 пациент (29 пациентов с ишемической болезнью сердца, 29 пациентов с хронической сердечной недостаточностью различной этиологии и 43 пациентa, страдающих ишемией нижних конечностей).

Группа 1: 11 пациентов (средний возраст 49±8,7 лет, средний класс стенокардии напряжения 3,0±0,77 ФК ССS, ФВ ЛЖ 52,8±9,2%), которым было выполнено КШ в сочетании с введением генного препарата «Ангиостимулина».

Группа 2: 13 пациентов (средний возраст 51,4±6,7 лет, средний класс стенокардии напряжения 3,23±0,73 ФК CCS, ФВ ЛЖ 50,8±8,8%), которым при проведении КШ был введен генный препарат «Ангиостимулин» и проведена ТМРЛ.

Группа 3: 5 пациентов (средний возраст 56,8±9,8 лет, средний класс стенокардии напряжения 3,4±0,65 ФК CCS, ФВ ЛЖ), которым было выполнено ТМЛР в сочетании с введением «Ангиостимулина».

Группа 4: 10 пациентов (средний возраст 56,7±10,5лет) с ИБС (стенокардия напряжения III-IV ФК CCS) и ХСН (III-IV ФК NYHA, ФВ ЛЖ =37,7±13,7%), которым были введены клетки CD133+.

Группа 5: 12 пациентов (средний возраст 43,1±14,8лет) с ДКМП и ХСН (III-IV ФК NYHA, ФВ ЛЖ = 28,4±7,2%), которым были введены клетки CD133+.

Группа 6: 7 пациентов (средний возраст 55,1 ± 14,1лет), с длительным ревматическим анамнезом, после операции протезирования митрального клапана со сроком послеоперационного периода не менее 1 года, при отсутствии поражения аортального клапана и с сохранной функцией протеза митрального клапана, при отсутствии атеросклеротического поражения коронарных артерий, подтвержденного данными коронарографии, со сниженной сократительной функцией миокарда ЛЖ по данным эхокардиографии (ФВ ЛЖ=36,4±10%, III-IV ФК NYHA). Всем пациентам этой группы при проведении коронароангиографии были введены транскатетерно интрамиокардиально CD133+ клетки.

Группа 7: 14 пациентов, страдающих ХИНК, которым были введены клетки-предшественники CD133+.

Группа 8: 29 пациентов с ХИНК, которым был введен «Ангиостимулин».

Стандартная электрокардиография (ЭКГ) выполнялась на 6/12 канальном электрокардиографе MWZ BIOSET 8000 (Германия) со скоростью лентопротяжного механизма 25 мм/сек до и после операции в 12 стандартных отведениях.

Эхокардиография (ЭхоКГ) выполнялась на аппарате Hewlett Packard Sonos 5500 с использованием трансторакального S4 и чрезпищеводного Omniplane II датчиков до и после операции. Определение конечных размеров и объемов полости ЛЖ в систолу и диастолу выполнялось из стандартных позиций по методике Teichkholtz. Оценка фракции выброса миокарда левого желудочка осуществлялась по модифицированному методу Simpson из апикальной 4-х камерной проекции. Из этой же проекции проводилось измерение конечно-диастолического объема левого желудочка (КДО ЛЖ, мл) и конечно-систолического объема ЛЖ (КСО ЛЖ, мл) по формуле площадь-длина в модификации Simpson.

Проба с физической нагрузкой (тредмил – тест) выполнялась на системе сопровождения нагрузочных проб «Burdic Quest» (CША) по протоколу Bruce с применением системы 12 модифицированных отведений ЭКГ по методу Mason-Likar на фоне отмены антиангинальных препаратов в утренние часы до операции и перед выпиской пациентов после операции. Производилась оценка толерантности к физическим нагрузкам, оценивалась длительность нагрузки и наличие ЭКГ критериев ишемии.

Рентгеноэндоваскулярные методы исследования артерий. Всем пациентам с заболеваниями сердца была сделана вентрикулоангиография. В группе пациентов с ХИНК было выполнено ангиографическое исследование магистральных сосудов нижних конечностей. Селективная коронароангиография на этапе дооперационного обследования выполнялась на ангиографических установках «Angioscop D» фирмы Siemens (Германия) и «Integris – 3000» фирмы Phillips (Голландия) под местной анестезией по методу M. Jadkins с введением катетера в бедренную артерию по S. Seldinger. Применялся контраст «Омнипак». Анализ ангиограмм выполняли на установке «Integris - V3000» со скоростью киносъемки 25-50 кадров в секунду на пленку фирмы «Kodak». Характер и степень поражения коронарного русла определяли по классификации Ю.С. Петросяна и Л.С. Зингермана.

Синхронизированная с ЭКГ однофотонная эмиссионная компьютерная томография миокарда (синхро-ОФЭКТ). Проба с дозированной физической нагрузкой выполнялась на велоэргометре «Meditronic» фирмы Hellige (Германия) с помощью 12 канального электрокардиографа «Bioset-800» фирмы в положении сидя по стандартному протоколу, принятому в НЦССХ им. А.Н.Бакулева РАМН. Реконструкцию полученных томограмм выполняли с применением стандартной программы AUTOSPECT-plus, реализующей механизм обратного проецирования фильтрованных проекций.

Позитронная эмиссионная томография (ПЭТ). Для оценки метаболизма глюкозы применяли радиофармпрепарат (РФП) – фтордезоксиглюкозу, меченую фтором (18F-FDG), которую синтезировали по двухстадийному методу R. Hamacher и соавторов на автоматизированном модуле синтеза производства фирмы «Nuclear Interface» (Германия). За 1 час до введения РФП пациенты получали перорально 50 г глюкозы с целью увеличения концентрации глюкозы в крови и подавления потребления жирных кислот в миокарде, что способствовало более высокому накоплению 18F-FDG в миокарде и лучшей его визуализации. Исследование осуществляли на позитронном эмиссионном томографе «Exact 47» фирмы «Siemens» в статическом режиме сбора данных через 40 мин после внутривенной инъекции 370 МБк РФП. Эмиссионное сканирование длилось 20 мин, а трансмиссионное – 10 мин.

Оценка транскутанного напряжения кислорода в тканях осуществлялась с помощью монитора ТСМ-2 фирмы «Radiometer» (Дания) исходно перед введением стимулятора ангиогенеза, через 1, 3 и 6 месяцев после введения (в некоторых случаях дополнительно через 9 месяцев и 1 год). Во время исследования пациент находился в горизонтальном положении на спине с выпрямленными конечностями. Фиксация датчика осуществлялась по стандартной технологии, рекомендуемой фирмой – изготовителем прибора в первом межпальцевом промежутке на тыле стопы. Показатели регистрировались не ранее, чем через 20 минут после помещения откалиброванного датчика на место измерения.

Ультразвуковая допплерография сосудов нижних конечностей проводилась до операции на аппарате Hewlett–Packard Sonos 5500 c линейным сосудистым мультичастотным датчиком. Оценивалась проходимость сосудов, состояние комплекса интима-медиа-адвентиция, состояние просвета сосудов с оценкой степени их стенозирования.


загрузка...