ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ РЕАКТИВНОСТЬ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ВОЗДЕЙСТВИИ ЛАЗЕРНОЙ ГИПЕРТЕРМИИ С НАНОЧАСТИЦАМИ НА ОПУХОЛЕВЫЕ ТКАНИ (30.03.2009)

Автор: Терентюк Георгий Сергеевич

Биологические и биофизические эффекты введения в организм животных золотых плазмонно-резонансных наночастиц. На основе количественного определения содержания золота в биологических тканях экспериментальных животных методом атомно-абсорбционной спектроскопии нами было установлено, что спустя 24 часа после внутривенного введения золотые наночастицы накапливаются в основном в печени и селезенке. Впервые установлено, что накопление золотых наночастиц и обусловленные этим морфологические изменения в органах животных обладают размерной зависимостью. Наиболее высокая концентрация золота в органах наблюдалась при накоплении частиц диаметром 160 нм.

Рис. 5. Содержание золота в различных органах крыс через 24 часа после внутривенного введения наночастиц.

По данным гистологических исследований, после внутривенного введения наночастиц соответствующие изменения обнаруживаются не только в печени и селезенке, но и в других органах, в которых повышения содержания золота в тканях по сравнению с уровнем естественного фона спустя 24 часа после введения не было выявлено. Нами впервые показано, что изменения во внутренних органах при системном введении золотых наночастиц имеют размерно-обусловленный характер. Частицы диаметром 160 нм воздействуют на стенку сосудов, что приводит к вакуольной дистрофии их эндотелиальных клеток. Частицы диаметром 50 нм приводят к более выраженным изменениям во внутренних органах. В селезенке лимфатические узелки имеют атипичные периферические зоны и в них отсутствуют зоны размножения. В узелках наряду с сохраненными лимфоцитами видны множественные апоптозные тельца. В печени наблюдается выраженная дистрофия гепатоцотов и умеренная гиперемия. В легких в данном случае более выраженная гиперемия, очаговые кровоизлияния. В капсулах почечных телец наблюдается пролиферация эпителиальных клеток и в полости капсулы определяются единичные эритроциты. При введении частиц диаметром 15 нм возникает умеренная дистрофия паренхиматозных клеток внутренних органов и умеренные нарушения кровообращения.

В диссертационной работе впервые проведены количественные исследования размерной зависимости длительности циркуляции золотых наночастиц при их системном введении (рис.6). В ходе проведенного экспериментального исследования показано, что частицы наименьшего исследуемого диаметра (15 нм) циркулируют в крови значительно дольше, чем более крупные, что может быть связано с их рециркуляцией из депонирующих органов.

Рис. 6. Динамика концентрации золота в крови кролика после внутривенного введения 5 мл наночастиц.

?введения аппроксимируется экспоненциальной функцией с коэффициентом 0.013:

На перевитых опухолях рака почки нами получено статистически значимое повышение концентрации золота при пассивном накоплении золотых наночастиц в опухолевой ткани по сравнению с нормальными тканями. Установлено, что временная динамика повышения концентрации золота в опухолевой ткани при пассивном накоплении имеет два выраженных максимума, первый максимум наблюдается в первый час после введения, а второе повышение уровня золота происходит спустя 24 часа после введения (рис. 7). Повышение концентрации в первый час после введения связано с повышенной васкуляризацией опухоли и, соответственно, большим объемом циркулирующей в опухоли крови. Как свидетельствуют результаты экспериментальных исследований, проведенных в работе, концентрация золота в крови максимальна в первые 30 минут после введения частиц, а затем начинает экспоненциально снижаться. Следующие несколько часов концентрация золота в опухолевой ткани и соседних здоровых тканях отличается незначительно.

Рис. 7. Концентрация золота в ткани перевитой опухоли рака почки у крыс в зависимости от времени поcле внутривенного введения наночастиц. ?- контроль до введения частиц, ?- опухоль, ( - кожа, подкожная клетчатка, поперечно-полосатая мускулатура.

Спустя 24 часа концентрация золота в опухолевой ткани при рассматриваемом пассивном накоплении примерно в три раза превышает соответствующие значения в соседних нормальных тканях и достигает 1 мкг/мл. Данное значение существенно ниже концентрации золота, регистрируемой спустя сутки в печени и селезенке. В работе также предложена методика функционализации золотых наночаcтиц для повышения селективности накопления в меланоме путем конъюгирования с L-фенилаланином.

Нами впервые исследовано иммуномодулирующее воздействие золотых наночастиц при системном введении. Экспериментальные исследования включали сравнительный анализ восстановления иммунного ответа у собак при введении интерлейкина-2 и конъюгатов интерлейкина-2 с золотыми наночастицами после искусственно вызванного вторичного иммунодефицита. Восстановление иммунного ответа до исходных значений было получено в обеих группах (рис. 8), однако динамика этого процесса была различной. Принципиальное значение имеет тот факт, что изолированное введение интерлейкина-2 приводит к более быстрому результату, в этом случае восстановление показателей наблюдалось уже в первые 24 часа.

Рис. 8. Динамика показателей иммунитета при иммуносупрессии и последующей иммунокоррекции. ??? контроль без иммуностимуляции, ??? - интерлейкин-2, ??? - конъюгаты золотых наночастиц с интерлейкином-2.

Конъюгаты интерлейкина с золотыми наночастицами вызывают отклик иммунной системы, но наблюдается запаздывание иммунного ответа на 48-72 часа по сравнению с откликом на исходный не конъюгированный препарат интерлейкина-2. Кроме того, наблюдался и побочный эффект от введения конъюгатов интерлейкина с золотыми наночастицами, выразившийся в увеличении количества тромбоцитов в крови.

Биологические и биофизические эффекты экспериментальной лазерной гипертермии тканей животных с применением золотых плазмонно-резонансных наночастиц. Использование золотых плазмонно-резонансных наночастиц для фототермического воздействия на ткани экспериментальных животных имеет два основных аспекта: (1) - биоспецифическое «нацеливание» на определенные ткани или клетки и (2) - оптический плазмонный резонанс. При облучении наночастиц, локализованных в биологических тканях, лазерным излучением с длиной волны в области полосы поглощения происходит нагрев частиц и окружающих их клеток.

В настоящей работе на основе компьютерного моделирования проведены оценки пространственного распределения интенсивности поглощенного лазерного излучения в образцах биологических тканей, содержащих плазмонно-резонансные наночастицы, и получены оценки температурных эффектов, возникающих при различных режимах лазерного воздействия. В экспериментах на тестовых объектах измерено пространственное распределение повышения температуры в зависимости от концентрации наночастиц и времени лазерного воздействия. Исследования на тестовых объектах в сочетании с компьютерным моделированием были необходимы для определения распределения температуры по глубине тканей на основе данных термографического исследования поверхности. Экспериментальные исследования, проведенные в работе, показали, что при концентрации частиц 5·109 см-3 прогревается не весь освещаемый лазерным излучением объем, а только его поверхностный слой, толщина которого не превышает 5-7 мм. При уменьшении концентрации частиц в 4 раза глубина нагрева увеличивается в 2 раза, однако снижается максимально достигаемая температура. При концентрации частиц 5·109 см-3 повышение температуры раствора наночастиц составляет 40(C, а при 16-ти кратном разведении - 18(C. Данный эффект ограничивает оптимальный диапазон концентраций частиц в тех случаях, когда требуется одновременный равномерный прогрев тканей объемом более 1см3. Исследование температурной кинетики золотых наночастиц при лазерном облучении выявило нелинейность скорости повышения температуры. Как установлено нами, скорость нагрева определяется главным образом концентрацией наночастиц и в меньшей степени мощностью используемого излучения. Наиболее быстрый нагрев происходит за первые 100 секунд лазерного воздействия, а затем температура достигает насыщения. Снижение температуры после прекращения лазерного воздействия происходит в несколько раз медленнее, чем нагрев, и не зависит от концентрации наночастиц. Данный эффект приводит к тому, что реальное время нагрева может значительно превышать длительность непосредственного лазерного облучения.

Выявлено, что лазерная гипертермия с золотыми наночастицами in vivo обладает определенной спецификой. Для её объяснения необходимо прежде всего принимать во внимание эффектны терморегуляции, обусловленные локальным повышением перфузии крови и индуцированные лазерным излучением морфологические изменения тканей животного. При гипертермии опухолевых тканей существенное значение имеет максимально быстрое повышение температуры до заданного диапазона. Золотые наночастицы при этом позволяют значительно увеличить скорость нагрева. В настоящей диссертационной работе статистически значимо доказано, что при использовании плазмонно-резонансных наночастиц для лазерной гипертермии биотканей достигается повышение скорости нагрева в 10 раз. Автором разработана методика проведения термографических исследований при лазерной гипертермии опухолей у животных, на основе специально разработанной компьютерной программы проведен статистический анализ температурного распределения нормальных и патологически изменённых тканей. Получены экспериментальные двумерные распределения поверхностной температуры при различной глубине инъекции наночастиц лабораторным животным. Исследована динамика лазерной гипертермии при непрерывном и импульсном режимах воздействия. Отчетливо продемонстрировано проявление компенсаторных реакций организма в результате повышении скорости нагрева тканей.

Биологические эффекты, возникающие при лазерной гипертермии тканей животных, определяются не только абсолютными величинами повышения температуры, но и длительностью воздействия и временными характеристиками нагрева. Нагрев опухолевых тканей до 46-600С градусов сдерживает их пролиферацию и предположительно может стимулировать процессы апоптоза. Без наночастиц достичь указанного температурного диапазона удается за 5 минут, а при их использовании - за 30 секунд. Следует отметить такую особенность лазерной гипертермии с наночастицами in vivo, как первоначальное повышение температуры на 1-3 градуса выше устанавливающегося впоследствии стационарного значения температуры (рис. 9).

1, 3 - без наночастиц; 2, 4 - с наночастицами. Выходная мощность лазера в непрерывном режиме 2 Вт, расстояние от торца волокна до поверхности кожи 2 см, средняя плотность мощности 2 Вт/см2, скважность в импульсном режиме 1/4, длительность импульса 1 мсек, пиковая мощность 4 Вт.

Нами сопоставлены возникающие в биологических тканях изменения, определяемых методами гистологического анализа с термограммами, измеренными на поверхности их локальных участков непосредственно после лазерного воздействия при разных способах введения золотых наночастиц. При этом показано, что проведение лазерного термолиза с использованием наночастиц, локализованных на глубине до 5-7 мм в биологических тканях, в частности, в коже и скелетных мышцах, позволяет селективно нагревать заданные участки в области локализации частиц без разрушения близлежащих тканей (рис.10).

Рис 10. Локальное повышение температуры и соответствующие морфологические изменения тканей экспериментальных животных при лазерном воздействии с золотыми наночастицами в непрерывном режиме с выходной мощностью 2,5 Вт, длительностью 30 сек. А – препарат кожи крысы до воздействия. Б – термограмма поверхности соответствующего участка кожи при подкожном введении золотых наночастиц. В – препарат кожи крысы после подкожного введения наночастиц и лазерного воздействия. Г – препарат скелетной мышечной ткани крысы до воздействия. Д – термограмма поверхности соответствующего участка кожи крысы при внутримышечном введении золотых наночастиц. Е – препарат скелетной мышечной ткани крысы после лазерного воздействия с наночастицами. Окр. гематоксилин-эозин. (Ув. х200).

В работе исследованы патоморфологические изменения тканей под воздействием лазерного излучения с использованием золотых наночастиц в качестве селективного поглотителя и иммуномодулирующие эффекты, возникающие при этом у экспериментальных животных с перевитыми и спонтанными опухолями. Накопление наночастиц в опухолевой ткани приводит к селективному нагреву в области их локализации. Как показывают результаты термографических измерений, пассивное накопление золотых наночастиц при внутривенном введении оказывается достаточным для того, чтобы температура поверхности опухолевой ткани при лазерной гипертермии была выше температуры окружающих здоровых тканей. При плотности мощности лазерного излучения 2 Вт/см2 температура на поверхности здоровой ткани повышалась на 50С, а опухолевой на 100С. Такое повышение температуры наблюдалось при лазерном воздействии через 30 минут после внутривенного введения частиц, что коррелирует с первым пиком насыщения опухолевой ткани золотыми наночастицами вследствие ее повышенной васкуляризации, который приходится на временной промежуток от 30 до 60 минут после внутривенного введения. Повышение температуры при интерстициальном введении наночастиц в опухоль выражено значительнее, чем при внутривенном введении, поскольку такое введение позволяет достичь более высокой локальной концентрации наночастиц. Максимальная температура поверхности кожи над опухолью при той же плотности мощности лазерного излучения при интерстициальном введении достигает 56оС. Установлено, что использование наночастиц при лазерной гипертермии позволяет повысить стабильность требуемого температурного режима, при котором диапазон колебания температуры не превышает одного градуса. После лазерной гипертермии с интерстициальным введением золотых наночастиц в эпидермисе кожи над опухолью наблюдается незначительная дистрофия, в кровеносных сосудах выражена сепарация крови и плазма вакуолизирована. В дерме наблюдается лимфоидная инфильтрация, набухшие волокна с признаками отека. В ткани опухоли (рис. 11-Б) имеются достаточно обширные некрозы лентовидной формы. В области некроза клетки опухоли отсутствуют, имеются бесструктурные эозинофильные массы с полиморфноклеточной воспалительной реакцией и множество апоптозных телец. Определение степени выраженности апоптотических процессов до и после лазерного воздействия осуществлялось с помощью иммуноцитохимических и иммуногистохимических исследований с использованием маркера Bcl-2. Полученные результаты показывают, что маркер Bcl-2 лучше использовать при лимфоидной инфильтрации опухоли, или для определения перифокального воспаления после термического воздействия на опухолевые ткани.

Рис. 11. А - препарат опухолевой ткани подкожно трансплантированного рака почки у крысы, Б - препарат опухолевой ткани с интерстициальным введением золотых нанооболочек после лазерного воздействия, окраска гематоксилин-эозин, ув. х150.

Лазерная гипертермия перевитых опухолей при внутривенном введении наночастиц приводит к уменьшению размера опухоли в среднем на 25% и средней задержке роста опухоли на 7 дней, а при интерстициальном введении наночастиц отмечалось уменьшение размера опухоли в среднем на 50% и задержка роста на 10 дней (рис. 12).

Рис. 12. Динамика роста подкожно трансплантированного рака почки крыс (РА) до и после лазерной гипертермии. ?- контрольная группа без воздействия, ?- группа с лазерным нагревом без наночастиц, ?- группа с лазерным воздействием после внутривенного введения наночастиц, ( - группа с лазерным воздействием после интерстициального введения наночастиц.

В группе животных, подвергшихся лазерному воздействию без наночастиц, с температурой нагрева в диапазоне 40-42оС, отмечалось незначительное ускорение роста опухоли по сравнению с контрольной группой. Продолжительность жизни животных указанной группы была ниже, чем в контрольной.

В исследовании проанализировано состояние иммунологической реактивности экспериментальных животных при экспериментальной локальной лазерной гипертермии. Поскольку среди спонтанных опухолей у изученных нами животных наиболее часто встречаются поверхностно расположенные опухоли эпителиальной тканевой природы, а лазерная гипертермия является методом наиболее целесообразным для воздействия на поверхностно расположенные ткани, в настоящем исследовании более детально рассматриваются эпителиальные опухоли и меланома слизистой оболочки ротовой полости.

Локальная гипертермия, в отличие от общей, стимулирует различные звенья иммунной системы организма. В то же время сильная термическая травма, равно как и хирургическая, может вызывать супрессию клеточного иммунитета (Munford R.S., Pugin J., 2001). В работе A. Szasz и G. Vincze (2006) отмечается, что в процессе гипертермии с клетками может происходить три процесса: они могут вернуться к своему первоначальному состоянию, подвергнуться апоптозу, либо погибнуть вследствие некроза. Точный механизм действия гипертермии неизвестен, но можно указать на следующие общепринятые положения. Повышение температуры вызывает расширение сосудов и непрерывное увеличение перфузии крови в здоровых тканях. Повышение температуры приводит также к структурным изменениям трансмембранных белков, вызывающим изменения в активном мембранном транспорте и проницаемости мембраны, в свою очередь приводящим к изменению ионных градиентов калия, натрия и кальция. Кроме того, гипертермия повышает скорости многих метаболических процессов. Однако при этом недостаток кислорода может приводить к снижению метаболизма вследствие гипоксии и образованию молочной кислоты в результате анаэробного метаболизма и разрушению клеток вследствие ацидоза. В лихорадочном диапазоне температур в опухолях возникают те же самые изменения, но при более высоких температурах в некоторых опухолях происходит вазоконстрикция, приводящая к уменьшению перфузии крови и уменьшению теплопроводности, при этом направление расширения сосудов в пограничных с опухолью здоровых тканях меняется, приводя к повышению перфузии крови и теплопроводности в этом регионе.

Кроме непосредственных биологических тканевых эффектов фототермолиза с золотыми наночастицами в настоящей работе выявлен ряд его иммуномодулирующих эффектов. Согласно результатам наших исследований на животных с базальноклеточным раком кожи, локальная лазерная гипертермия приводит к следующим изменениям иммунологической реактивности. Динамика состояния организма, поражённого опухолью характеризуется повышением уровня паратгормоноподобного белка, при этом максимальное значение данного показателя соответствует моменту максимального разрушения опухолевой ткани. Повышение объема циркулирующих в кровотоке опухолевых антигенов в процессе разрушения опухоли приводит к увеличению процентного содержания натуральных киллеров и уменьшению отношения CD4/CD8 позитивных клеток, а также повышению количества продуцируемого CD4-позитивными клетками интерлейкина-2. После максимальной элиминации опухолевых клеток происходит снижение указанных выше показателей до физиологической нормы. Динамика изменения указанных показателей коррелирует с интервалами между лазерными воздействиями. Использование золотых наночастиц при лазерной гипертермии позволяет достичь элиминации эквивалентного объема опухоли при меньшей длительности воздействия, при этом наблюдается более выраженный иммунный отклик. Иммунный отклик организма животного на пролонгированную стимуляцию опухолевыми антигенами проявляется в повышении процентного содержания натуральных киллеров и уровня интерлейкина-2 и иммуноглобулинов IgG, снижению соотношения CD4/CD8 позитивных клеток. Уровень антигенности опухоли коррелирует с уровнем паратгормоноподобного белка. Лазерный фототермолиз, как и инструментальное удаление опухоли, при моделировании можно рассматривать как резкое уменьшение объема опухолевой ткани в организме, возможно приводящее к силовому переключению биологического триггера. Кроме того, лазерный фототермолиз, как установлено нами, обладает рядом статистически значимых иммуномодулирующих эффектов.

В исследовании установлены различия в чувствительности различных гистологических типов опухолей к лазерной гипертермии с наночастицами. Так, в случае неороговевающего плоскоклеточного рака кожи для достижения полной элиминации опухоли достаточно было однократного воздействия и иммунный ответ организма на воздействие был выражен слабо, а при ороговевающем плоскоклеточном раке кожи у собак лазерное воздействие для достижения полной элиминации опухоли необходимо было применять многократно. В случае неороговевающего плоскоклеточного рака кожи полной элиминации опухоли удавалось достичь за 1 сеанс (37%) или за 2 сеанса (63%). В случае ороговевающего плоскоклеточного рака кожи элиминация опухоли достигалась за 3 сеанса (25%) или 4 сеанса (75%). Полученные результаты свидетельствуют о более высокой устойчивости клеток ороговевающего плоскоклеточного рака к лазерной гипертермии по сравнению с клетками неороговевающего плоскоклеточного рака кожи у собак. В последнем случае длительность безрецидивного периода составляла от 6 до 8 месяцев в 30% случаев, в 25% случаев длительность безрецидивного периода составляла от 8 до 12 месяцев, в остальных 45% случаев длительность безрецидивного периода составляла от 12 до 18 месяцев. В случае ороговевающего рака кожи безрецидивный период составлял от 6 до 8 месяцев у 5% собак, от 8 до12 месяцев – у 20% собак, от 12 до 18 – у 35%, и у 40% - от 18 до 24 месяцев. Эти различия обусловлены, на наш взгляд, специфическими тканевыми особенностями этих опухолей и исходным состоянием иммунологической реактивности экспериментальных животных.

Проведенный в работе сравнительный анализ состояния иммунологической реактивности экспериментальных животных с меланомой слизистой рта показал, что как изолированная иммуномодуляция (1 группа), так и иммуномодуляция в сочетании с лазерной гипертермией с золотыми наночастицами (2 группа) приводит к повышению уровня иммуноглобулинов до нормальных значений, однако изолированная иммуномодуляция приводит к кратковременному эффекту с тенденцией к снижению в течении 14 дней, а в сочетании с лазерной гипертермией нормализация показателей сохраняется в течение 30 дней после окончания воздействия. Селективной лазерная гипертермии с золотыми наночастицами, в отличие от изолированной иммуномодуляции, повышает процентное содержание В-лимфоцитов и NK-клеток. Повышение уровня интерлейкина-2 в крови животных при изолированной иммуномодуляции имело пиковый характер, а иммуномодуляция в сочетании с гипертермией приводила к более раннему иммунному ответу, причем повышенный уровень интерлейкина-2 оставался стабильным в течение всего срока наблюдения.

Биоинформационная модель взаимодействия иммунной системы и опухолевого процесса в условиях воздействия биологических и биофизических эффектов управляемого лазерного фототермолиза с золотыми наночастицами. В работе сформулированы основные биологические закономерности взаимоотношения опухоли с иммунной системой организма, необходимые для построения адекватной математической модели. Проведен анализ требований к математической модели коррекции опухолевого иммунодефицита. В работе впервые проведено математическое моделирование иммунологической реактивности организма при лазерной гипертермии опухолевой ткани. Представленную в работе математическую модель, описывающую нелинейную динамику системы антиген–«антитело»–интерлейкин, можно рассматривать как обобщение моделей иммунной системы, предложенных ранее [Романовский Ю.М, Степанова Н.В, Чернавский Д.С., 1984], [Kirschner D., Panetta J.C., 1998]. Обобщение указанных моделей заключается в учете влияния продуктов биодеградации ткани при лазерной гипертермии на иммунологическую реактивность организма. Также учитывается динамика поступления извне интерлейкина-2 дискретно или непрерывно. Каждый параметр модели был получен с использованием фактических экспериментальных данных. Когда фактические данные отсутствовали, параметры выбирались таким образом, чтобы максимально соответствовать имеющимся экспериментальным данным о динамике опухолевого роста. Предложенная модель лазерной гипертермии учитывает как эффекты уменьшения опухоли вследствие термической деструкции, так и иммунный ответ на повышение антигенпрезентации продуктов распада опухоли. Полученная в результате математическая модель включает три дифференциальных уравнения:

— функция Хевисайда, количество продуктов распада после гипертермии опухоли спадает по экспоненте.

Предложенная модель в зависимости от управляющих параметров демонстрирует различные режимы динамики, которые качественно согласуются с представлениями о поведении иммунной системы. Без лазерного воздействия могут наблюдаться следующие ситуации. Для низкого уровня антигенности существует стабильное устойчивое состояние опухоли большого размера, которого достигает система. Для более высокого уровня антигенности имеется цикл с небольшой амплитудой и коротким периодом, при очень высоком уровне антигенности организм может действительно уничтожить опухоль. Все эти моменты рассматриваются при моделировании с реальными параметрами, чтобы получить прогнозы развития ситуации. Если скорость размножения антигена велика, в фазовом пространстве существуют два неустойчивых положения равновесия, а также одно устойчивое положение. При однократном лазерном воздействии даже при практически полном выжигании опухоли модель предсказывает возобновление опухолевого роста. При трехкратном проведении процедуры лазерного фототермолиза опухоли в зависимости от объема выжигаемой опухолевой ткани моделируемая система демонстрирует различные сценарии развития ситуации – от возобновления роста опухоли до практически полного исчезновения опухоли (рис.13).

объем выжигаемой ткани).

При одинаковых количественных параметрах фототермического воздействия на опухоль, но при различных коэффициентах стимуляции иммунной системы, зависящих от длительности периода полураспада продуктов опухоли после фототермолиза, сценарии поведения моделируемой системы могут кардинально различаться. Развитие ситуации после лазерной гипертермии также зависит от исходного состояния иммунной системы и выраженности повышения антигенпрезентации в процессе лазерного термолиза с золотыми наночастицами. Причем очень незначительное изменение значений управляющих параметров, определяемых указанными процессами, может кардинально менять исход от полной элиминации опухоли до прогрессирования процесса. Результаты моделирования хорошо коррелируют с экспериментальными исследованиями на животных.

Заключение

Таким образом, в основе концептуальной схемы проведённого исследования реализован вариант системного информационного подхода к анализу иммунобиологического равновесия в системе «иммунитет-опухоль» в динамике спонтанных опухолевых процессов эпителиальной тканевой природы и в условиях эксперимента трансплантации культуры клеток рака почки. На разных этапах развития сложного многокомпонентного взаимодействия между специфическими и неспецифическими системами иммунологического надзора с опухолевыми клетками его динамика может быть представлена в виде биоинформационной модели нестабильного состояния между отдельными, в первую очередь ведущими, компонентами системы, переключение на стимуляцию или подавление которых осуществляют биологические триггеры двунаправленного действия (рис. 14). Факторы внешнего воздействия на систему на молекулярно-генетическом, тканевом и организменном уровнях запускают разные по направленности и неоднозначные по конечному эффекту процессы в зависимости от переключающего эффекта триггеров, смещая нестабильное равновесие системы в ту или иную сторону. Специфика опухолевых процессов эпителиальной природы определяется в значительной степени гормональным фоном организма и чувствительностью клеток опухоли и иммунной системы к сигналам гормонов, причём продуцентами гормонов могут выступать, в том числе и сами опухолевые ткани. Модификаторами гормонального фона и иммунной системы, стимулирующей направленности могут выступать фармакологические агенты и иммуномодуляторы естественной природы, совокупные эффекты которых проанализированы нами отдельно для определения их роли в изменении ключевых показателей иммунитета. Эта группа факторов представляет один из векторов системы стремящегося остановить процесс развития опухоли и элиминировать их из организма животного. Аналогичным по направленности, но отличным по механизмам действия является вектор другой группы модификаторов. В качестве такой группы модификаторов выступают физические воздействия на опухоль (хирургическое удаление, облучение, термолиз). Их иммуномодулирующие эффекты также разнонаправлены и неоднозначны по конечным эффектам на нестабильное равновесие системы. Одними из важнейших временных факторов при этом выступает динамика многоэтапного процесса развития опухоли и её чувствительность к физическим воздействиям с одной стороны, и время физического воздействия, как фактор, определяющий развитие конечных биологических эффектов и переключение триггеров на стимуляцию или подавление иммунитета с другой.

Рис. 14. Концептуальная биоинформационная модель анализа взаимодействия иммунной системы и опухолевого процесса эпителиальной природы в условиях воздействия биологических и биофизических эффектов управляемого лазерного фототермолиза.

В этом смысле поиск наиболее быстрых по времени воздействия, точных по его направленности и естественных по конечным эффектам способов удаления опухолей эпителиальной природы представляет собой важнейшую научную проблему экспериментальной онкологии. На основе полученной в настоящем исследовании базы данных разработана и экспериментально верифицирована биоинформационная модель системы «иммунная система-опухоль». Обучение на полученной базе данных бинарного нейросетевого классификатора полностью подтвердило возможность эффективного использования ряда ключевых показателей иммунной системы, биохимических параметров сыворотки крови для анализа и прогнозирования возможных исходов опухолевых процессов эпителиальной природы. Разработанная биоинформационная модель нелинейной динамики нестабильного равновесия системы «иммунитет-опухоль», основанная на реальных экспериментальных данных демонстрирует 4 основных вида её состояния в виде графических портретов фазовых переходов: а) – неустойчивое равновесие, высокая скорость нарастания концентрации опухолевых антигенов, низкая реактивность иммунной системы и гибель организма независимо от исходных условий состояния системы, б) - неустойчивое равновесие с высокой скоростью нарастания опухолевых антигенов и высокой реактивностью иммунной системы с исходом в зависимости от условий начального состояния системы, в) - устойчивое равновесие динамики перехода в хроническое заболевание, выздоровление или гибель в зависимости от исходных условий состояния системы, в) – неустойчивое равновесие динамики полного выздоровления и регистрации процесса в иммунологической памяти организма. На основе разработанной биоинформационной модели теоретически предсказана и экспериментально подтверждена возможность стимуляции иммунного ответа при локальной лазерной гипертермии, причём эффективность такого воздействия многократно возрастает при использовании золотых плазмонно-резонансных наночастиц. Использованный в настоящем исследовании лазерный фототермолиз с применением золотых плазмонно-резонансных наночастиц по своим биофизическим эффектам (селективный нагрев тканей на заданной глубине, повышение скорости их нагрева, динамика уменьшения объёма опухоли) и биологическим эффектам реакций на термовоздействие (ожоговый стресс, воспаление, стимуляция апоптоза, стимуляция иммунитета продуктами послеожоговой биодеградации тканей) обладает комплексным иммуномодулирующим действием. В исследовании экспериментально доказано, что при согласовании длины волны лазерного излучения, соответствующей окну прозрачности биоткани и пика поглощения плазмонно-резонансных золотых наночастиц возможна точная, высокоэффективная и быстрая деструкция опухолевых тканей эпителиальной природы на глубине до 8 мм без повреждения вышележащих слоёв неизменённых тканей.

1. Частота встречаемости исследованных опухолей у животных зависит от пола: у животных женского пола преобладает рак молочных желез, мужского - рак параанальных желез и меланома слизистой оболочки ротовой полости. Низкодифференцированные формы рака составляют 10% всех эпителиальных злокачественных опухолей. Основными гистологическими типами опухолей у собак являются протоковый рак молочных желез высокой и средней степени дифференцировки, высокодифференцированные цистокарцинома и аденокарцинома яичников, солидные формы базальноклеточного рака кожи, высокодифференцированные аденокарциномы предстательной и параанальных желез, эпителиоподобный и невусоподобный варианты меланомы слизистой оболочки ротовой полости.

2. Развивающееся в динамике опухолевого процесса иммунодефицитное состояние животных, выражается в снижении содержания иммуноглобулинов классов IgG и IgM, процентного содержания NK-клеток и общей лимфоцитопении и сопровождается таким дисбалансом эндокринной системы, как повышение уровня кортизола, эстрадиола, прогестерона, кальцитонина и паратгормоноподобного белка.


загрузка...