Клинико-экспериментальное обоснования использования иммуномодуляторов в комплексной терапии наружного генитального эндометриоза (30.03.2009)

Автор: Павлов Роман Владимирович

Учитывая обнаруженное снижение активности Т-клеточного и ЕК звена противоопухолевого иммунитета, а также дефицит в продукции ИФН( и ИЛ2 у больных НГЭ, патогенетически обоснованным подходом в селективной иммунотерапии этого заболевания представляется использование интерферонотерапии или применение экзогенного ИЛ2 человека, в частности, в форме отечественных препаратов Реаферона-ЕС и Ронколейкина. Кроме этого, принимая во внимание преимущественно локальный характер иммунных нарушений при НГЭ, целесообразно проведение селективной иммунотерапии на местном уровне.

Для подтверждения этого заключения на доклиническом этапе, в эксперименте in vivo, нами оценивалась эффективность, безопасность и возможный механизм действия местного применения Ронколейкина и крысиного ?2-интерферона в качестве селективной иммунотерапии экспериментального эндометриоза (ЭЭ) у крыс.

Согласно полученным данным, при аутотрансплантации фрагмента маточного рога на внутреннюю поверхность передней брюшной стенки ЭЭ развивается в месте трансплантации в 100 % случаев. При этом макроскопически очаги ЭЭ на поверхности париетальной брюшины выглядят как участки красного (8 из 20 случаев) или черного (12 из 20 случаев) цвета с кистами, заполненными прозрачным или геморрагическим содержимым.

При визуальном сравнении участков трансплантатов у крыс, получавших селективную иммунотерапию, красные участки встречались в 4 случаях из 40, в 14 случаях выявлялись белые очаги, которых не было у животных контрольной группы.

При обзорной микроскопии на фоне лечения (2-интерфероном у 10 крыс (50,0 %), а на фоне лечения Ронколейкином у 12 (60,0 %) в области места трансплантации маточного рога эктопический эндометрий отсутствовал, что позволило нам сделать вывод о полном регрессе эндометриоидных гетеротопий у этих животных.

Основными гистологическими вариантами регресса очагов ЭЭ были полное его замещение соединительной тканью (9 крыс, получавших Ронколейкин, и 5 – (2-интерферон) или мультикистозная дегенерация (3 крысы, получавшие Ронколейкин, и 2 – (2-интерферон). Некроз очага ЭЭ не развился ни у одной крысы, получавшей Ронколейкин, зато наблюдался у 2 животных, получавших (2-интерферон.

В случае сохранения эндометриоидных желез на фоне проводимой иммунотерапии происходит достоверное уменьшение их площади, степень выраженности которой не зависит от используемого препарата. Так, средняя площадь эндометриоидных желез у животных, не получавших лечение, составляла 11,29(1,94 % от площади трансплантата, на фоне применения Ронколейкина она уменьшалась до 6,01(1,06 %, а на фоне приема (2-интерферона – до 5,96(1,47 % (р<0,001).

Высота эпителия очагов ЭЭ животных, не получавших лечение, составляла 14,10(0,74 мкм, площадь ядер – 19,97(0,76 мкм2, количество ОЯОР в ядре – 2,63(0,16, средняя площадь одного ОЯОР – 1,61(0,09 мкм2, суммарная площадь ОЯОР в ядре – 3,17(0,32 мкм2. На фоне применения цитокинотерапии все эти показатели пролиферативной активности клеток эктопического эндометрия, в случае его наличия, достоверно уменьшаются, и степень этого уменьшения также не зависит от используемого препарата. Так, после применения Ронколейкина высота эктопического эпителия уменьшается до 8,68(0,58 мкм, площадь ядер – до 15,58(1,44 мкм2, количество ОЯОР в ядре – до 2,05(0,07, средняя площадь одного ОЯОР до –1,06(0,04 мкм2, суммарная площадь ОЯОР в ядре – до 2,11(0,10 мкм2 (р<0,05). На фоне введения (2-интерферона высота эктопического эпителия уменьшается до 10,90(0,86 мкм, площадь ядер – до 15,00(0,97 мкм2, количество ОЯОР в ядре – до 2,10(0,12, средняя площадь одного ОЯОР – до 1,36(0,08 мкм2, суммарная площадь ОЯОР в ядре – до 2,42(0,08 мкм2 (р<0,05).

При анализе степени васкуляризации очагов ЭЭ было выявлено достоверное снижение всех ее параметров у животных, получавших селективную иммунотерапию. В участках трансплантатов маточного рога крыс, не получавших лечение, процент площади просвета сосудов от площади трансплантата составлял 10,79(0,70 %, средняя площадь просвета капилляра составляла 107,97(9,73 мкм2, площадь ядер эндотелиальных клеток – 10,33(0,64 мкм2, средняя площадь одного ОЯОР в ядрах эндотелиальных клеток была 0,74(0,09 мкм2, а суммарная площадь ОЯОР в ядре – 1,35(0,08 мкм2. После применения Ронколейкина процент площади сосудов от площади трансплантата уменьшался до 8,11(0,95 %, средняя площадь просвета капилляра – до 77,30(6,00 мкм2, площадь ядер эндотелиальных клеток – до 8,69(0,36 мкм2, средняя площадь одного ОЯОР – до 0,53(0,05 мкм2, суммарная площадь ОЯОР в ядре – до 0,86(0,11 мкм2 (р<0,05). На фоне введения (2-интерферона процент площади сосудов от площади трансплантата уменьшался до 8,00(1,00 %, средняя площадь просвета капилляра – до 63,38(5,53 мкм2, площадь ядер эндотелиальных клеток – до 7,91(0,41 мкм2, средняя площадь одного ОЯОР – до 0,54(0,04 мкм2, суммарная площадь ОЯОР в ядре – до 0,83(0,05 мкм2 (р<0,05).

Согласно полученным данным, на фоне проводимой иммунотерапии в участках трансплантации маточного рога возрастает интенсивность лейкоцитарной инфильтрации за счет лимфоцитов, а количество макрофагов в составе лейкоцитарных инфильтратов достоверно снижается. Так, у животных, не получавших лечение, на долю лимфоцитов, инфильтрирующих область трансплантата, приходится 91,69(0,95 % клеток, а на долю макрофагов – 2,00(0,25 %. После применения Ронколейкина процент лимфоцитов увеличивается до 95,80(0,85 %, а макрофагов снижается до 0,83(0,17 % (р<0,05). На фоне введения (2-интерферона процент лимфоцитов увеличивается до 93,99(0,57 %, а макрофагов снижается до 1,29(0,14 % (р<0,05).

На фоне проводимого лечения изменяется не только состав лейкоцитарных инфильтратов участков трансплантации маточного рога, но и состав ПЖ экспериментальных животных. Так, у животных, не получавших лечение, на долю лимфоцитов в ПЖ приходилось 45,74(0,69 % клеток, а на долю макрофагов – 33,61(1,16 %. После применения Ронколейкина процент лимфоцитов в ПЖ увеличился до 57,98(0,96 %, а макрофагов снизился до 25,37(0,88 % (р<0,05). На фоне введения (2-интерферона процент лимфоцитов в ПЖ увеличился до 55,88(1,08 %, а макрофагов снизился до 28,62(0,84 % (р<0,05).

Таким образом, на фоне внутрибрюшного введения (2-интерферона полный регресс очагов ЭЭ у крыс происходит в 50 % случаях, а на фоне введения Ронколейкина – в 60 %. В случае сохранения эндометриоидных желез на фоне проводимой иммунотерапии происходит достоверное уменьшение их площади и снижение пролиферативной активности клеток эндометриоидного эпителия.

Выявленные изменения в составе лейкоцитарных инфильтратов очагов ЭЭ и ПЖ животных, получавших иммунотерапию, позволяют предположить, что возможным механизмом действия (2-интерферона и Ронколейкина, ведущим к регрессу ЭЭ, может являться увеличение противоопухолевой активности лимфоцитов и уменьшение проангиогенной активности макрофагов. Дополнительным подтверждением этого предположения можно считать снижение степени васкуляризации очагов ЭЭ и уменьшение активности эндотелиальных клеток на фоне проводимого лечения.

Эффективность комплексного лечения наружного генитального эндометриоза с использованием селективной иммунотерапии

Учитывая положительные результаты селективной иммунотерапии эндометриоза, полученные в эксперименте, на завершающем этапе диссертационного исследования нами была проведена апробация предлагаемого метода комплексной терапии НГЭ в клинике.

Согласно нашим данным, в группе больных, получавших Ронколейкин, интенсивность и продолжительность болевого синдрома в послеоперационном периоде была меньше, чем в группах больных, получавших Реаферон-ЕС и Бусерелин-депо. Так, если в группе, получавшей Ронколейкин, в первые сутки после операции болевой синдром, требующий медикаментозного вмешательства, наблюдался у 17 больных, то в группах, получавших Реаферон-ЕС и не получавших иммунотерапию, – у всех пациенток.

Для больных, получавших Ронколейкин и Реаферон-ЕС, в послеоперационном периоде характерно наличие температурной реакции, которая была более выраженной как по продолжительности (в контрольной группе 1-2 дня, в основной – 2-4 дня), так и по интенсивности (в контрольной группе максимальное повышение температуры до 370,5 С, в основной, получавшей Ронколейкин, – до 380,1 С, Реаферон-ЕС – до 380,6 С). Подобная температурная реакция являлась побочным эффектом цитокинотерапии и существенно не влияла на общее самочувствие больных.

В течение месяца селективной иммунотерапии Ронколейкином и Реафероном-ЕС у части больных наблюдались «цитокиновые реакции» в виде гипертермии, озноба и боли в месте инъекции, все они носили кратковременный характер, как правило, не требовали медикаментозной коррекции, не оказывали существенного влияния на общее состояние больных и прекращались сразу после завершения лечения.

В отличие от «цитокиновых реакций» клинические проявления, характерные для гипоэстрогении, развивающейся в течение 6 месяцев на фоне приема Бусерелина-депо (аменорея, чувство приливов жара, снижение либидо, эмоциональная лабильность, сухость влагалища, боли в спине при физической нагрузке), негативно сказывались на общем состояние больных.

До начала лечения показатели иммунной системы ПК между группами достоверно не отличались и полностью соответствовали ранее выявленной иммунной дисфункции. В ПК больных НГЭ всех групп было выявлено увеличение количества моноцитов, снижение относительного количества CD3, CD4, CD8, CD16 и CD25-лимфоцитов, увеличение продукции МНК ПК in vitro ФНО(, ИЛ1(, ИЛ6 и ИЛ8 и снижение продукции ИФН(.

Через 1 месяц после операции у больных, получавших Бусерелин-депо, не наблюдалось существенных изменений в клеточном составе и цитокинпродуцирующей активности иммунокомпетентных клеток ПК. У женщин, получавших во время и после лапароскопии селективную иммунотерапию, сразу после завершения курса лечения относительное количество CD3, CD4, CD8-лимфоцитов ПК не отличалось от нормальных значений, а относительное количество CD16 и CD25-лимфоцитов достоверно возрастало. При этом увеличение относительного количества CD16-лимфоцитов было более выраженным в группе, получавшей Реаферон-ЕС, а CD25-лимфоцитов – в группе, получавшей Ронколейкин.

После завершения иммунотерапии уровень продукции МНК ПК in vitro ФНО( не отличался от нормальных значений. В группе, получавшей Ронколейкин, уровень ИЛ6 снижался на 27,0 %, а ИЛ8 – в 3,1 раза. В группе, получавшей Реаферон-ЕС, уровень продукции ИЛ6 снижался на 10,0 %, а ИЛ8 – в 2,8 раза. У больных, в комплексной терапии которых использовался Ронколейкин через 1 месяц после лапароскопии, отмечалось увеличение продукции ИЛ1( в 2 раза, ИЛ2 – в 4,1 раза и ИФН( – в 3,5 раза. У пациенток, получавших Реаферон-ЕС, уровень продукции ИЛ1( превышал норму в 1,6 раза, ИЛ2 – в 3,5 раза, зато уровень продукции ИФН( возрастал в 5 раз по сравнению с нормой.

Через 6 месяцев после операции у больных, получавших Бусерелин-депо, клеточный состав иммунокомпетентных клеток ПК не отличался от исходных показателей. В группах, получавших селективную иммунотерапию, через 6 месяцев после операции относительное количество CD3, CD4, CD8-лимфоцитов в ПК не отличалось от нормальных значений. В группе, получавшей Ронколейкин, количество CD16-лимфоцитов и моноцитов не отличалось от нормы, а количество CD25-лимфоцитов оставалось повышенным; в группе, получавшей Реаферон-ЕС, в ПК сохранялось повышенное количество CD16-лимфоцитов, а количество CD25-лимфоцитов не отличалось от нормы.

Через 6 месяцев после операции в группе больных, получавших Бусерелин-депо, сохраняется достоверное увеличение, по сравнению с нормой, продукции МНК ПК in vitro ИЛ1( на 20,9 %, ФНО( – на 40,3 %, ИЛ6 – в 1,5 раза, ИЛ8 – в 4,2 раза, а уровень продукции ИФН( остается пониженным на 28,4 %. МНК ПК больных, получавших Ронколейкин и Реаферон-ЕС, через 6 месяцев после лапароскопии продуцировали нормальное количество ИЛ1(, ИЛ6, ИЛ8, ФНО( и ИФН( вне зависимости от используемого препарата. Обращает на себя внимание, что в группе, получавшей Ронколейкин, уровень продукции ИЛ2 оставался повышенным в 1,7 раза по сравнению с нормальным значением.

Таким образом, на фоне приема Ронколейкина и Реаферона-ЕС у больных НГЭ отмечается существенное увеличением активности клеток, реализующих Th1 иммунный ответ, а также формируется тенденция к нормализации повышенной активности макрофагов. Через 5 месяцев после завершения курса лечения Ронколейкином и Реафероном-ЕС наблюдается нормализация основных иммунологических показателей, нарушения которых были зарегистрированы у больных НГЭ до начала лечения, при этом в группе больных, получавших Ронколейкин, сохранялась повышенная активность Th1-иммунного ответа. Полученные данные позволяют утверждать, что селективная иммунотерапия НГЭ с применением Ронколейкина и Реаферона-ЕС обладает иммунорегуляторным действием в отношении именно тех звеньев иммунной системы, нарушения в которых регистрируются у больных до начала лечения.

До начала терапии болевой синдром в виде дисменореи, тазовых болей, не связанных с менструацией, диспареунии и боли в крестце имел место у 38 (95,0 %) больных, получавших Ронколейкин; у 37 (92,5 %), получавших Реаферон-ЕС, и у 39 (97,5 %) больных, получавших Бусерелин-депо. Через 1 месяц после операции болевой синдром отсутствовал у всех больных основных и контрольной групп. В течение 12 месяцев после завершения иммуноориентированной и гормональной терапии количество рецидивов болевого синдрома в группе, получавшей Ронколейкин, составило 17,5 %, в группе получавшей, Реаферон-ЕС, – 22,5 % и в группе, получавшей Бусерелин-депо, – 32,5 % (рис. 1).

Рис. 1. Динамика болевого синдрома у больных НГЭ после хирургического удаления очагов эндометриоза с последующим проведением иммуноориентированной или гормональной терапии

До начала лечения нарушения менструальной функции в виде гиперполименореи и мажущих кровянистых выделений до и после менструации отмечались у 21 (52,5 %) больной, получавшей после лапароскопии Ронколейкин; у 20 (50,0 %), получавших Реаферон-ЕС, и у 21 (52,5 %), получавшей Бусерелин-депо. Через 1 месяц после операции жалобы на нарушения менструального цикла сохранялись у 1 (2,5 %) больной в каждой группе, получавшей иммунотерапию, а в группе, получавшей Бусерелин-депо, таких жалоб не было. В течение 12 месяцев после завершения иммуноориентированной и гормональной терапии количество рецидивов нарушений менструальной функции в группе, получавшей Ронколейкин, составило 12,5 %, в группе, получавшей Реаферон-ЕС, – 15,0 % и в группе, получавшей Бусерелин-депо, – 12,5 %.

Резюмируя полученные клинические данные, можно утверждать, что частота возврата клинических проявлений НГЭ в случае его рецидива не зависит от используемого метода лечения, а отличается между группами только временем возникновения рецидива.

С целью контроля возможных бессимптомных рецидивов НГЭ в послеоперационном периоде у всех пациенток основных и контрольной групп оценивался уровень СА125 в ПК.

Рис. 2. Динамика уровня СА125 у больных НГЭ после хирургического удаления очагов эндометриоза с последующим проведением иммуноориентированной или гормональной терапии

До операции уровень СА125 выше 35 МЕ/мл определялся у 28 (70,0 %) больных, получавших Бусерелин-депо, у 29 (72,5 %) больных, получавших Ронколейкин, и у 30 (75,0 %) больных, получавших Реаферон-ЕС. Через 1 месяц после завершения лечения уровень СА125 выше 35 МЕ/мл был зарегистрирован у 2 (5,0 %) больных, получавших Ронколейкин и Реаферон-ЕС, и у 3 (7,5 %) больных, получавших Бусерелин-депо. Через 12 месяцев после завершения иммуноориентированной и гормональной терапии количество больных с уровнем СА125 выше 35 МЕ/мл составило 25,0 % в группе, получавшей Ронколейкин, 27,5 % в группе, получавшей Реаферон-ЕС, и 37,5 % в группе, получавшей Бусерелин-депо (рис. 2).

До начала лечения жалобы на бесплодие предъявляли 24 больные, получавшие впоследствии Ронколейкин, 22, получавшие Реаферон-ЕС и 22, получавшие Бусерелин-депо. Через 12 месяцев после завершения лечения беременность наступила у 17 (70,8 %) больных, получавших Ронколейкин, у 15 (68,2 %), получавших Реаферон-ЕС, и у 8 (36,4 %), получавших Бусерелин-депо (рис. 3).

Таким образом, частота наступления беременностей у пациенток с бесплодием была в 2 раза выше в группах, получавших Ронколейкин и Реаферон-ЕС (р<0,05). Необходимо отметить, что частота наступления беременности после хирургического удаления очагов НГЭ была максимальной в течение первых 6 месяцев после операции, и именно в это время на фоне гормонального лечения наблюдается медикаментозная аменорея. В дальнейшем вероятность наступления беременности снижалась.

Рис. 3. Частота наступления беременности у больных НГЭ после хирургического удаления очагов эндометриоза с последующим проведением иммуноориентированной или гормональной терапии

Из 17 женщин, беременность которых наступила на фоне приема Ронколейкина, беременность доносили 13 (76,5 %), из 15, получавших Реаферон-ЕС, – 11 (73,3 %), а из 8 беременных, получавших в послеоперационном периоде Бусерелин-депо, – 6 (75,0 %).

В соответствие с разработанным протоколом клинических испытаний через 12 месяцев после завершения лечения (13 месяцев после операции у больных, получавших иммунотерапию, и 18 месяцев после операции у больных, получавших Бусерелин-депо) у всех небеременных женщин с НГЭ была выполнена контрольная лапароскопия. При выполнении диагностической лапароскопии очаги эндометриоза на брюшине малого таза или яичниках были обнаружены у 13 больных, получавших Ронколейкин, (32,5 %), у 14 (35,0 %), получавших Реаферон-ЕС, и у 15 (37,5 %), получавших Бусерелин-депо.

При повторной лапароскопии наличие спаечного процесса было выявлено у 4 (10,0 %) больных, получавших Ронколейкин, у 6 (15,0 %), получавших Реаферон-ЕС, и у 15 (37,5 %) больных, получавших Бусерелин-депо. Двухсторонняя непроходимость маточных труб наблюдалась у 1 (2,5 %) больной, получавшей Ронколейкин и Реаферон-ЕС, и у 5 (12,5 %) больных контрольной группы.

Таким образом, частота рецидивов НГЭ после проведения в послеоперационном периоде селективной иммунотерапии Ронколейкином и Реафероном-ЕС не отличалась от частоты рецидивов НГЭ на фоне терапии агонистами ГнРГ. При этом в группах больных, получавших Ронколейкин и Реаферон-ЕС, частота выявления спаечного процесса и непроходимости маточных труб была ниже, чем в группе больных, получавших Бусерелин-депо, практически в три раза.

Предлагаемая схема применения Ронколейкина в комплексной терапии наружного генитального эндометриоза: после лапароскопического удаления или коагуляции очагов НГЭ, разъединения спаек и хромосальпингоскопии следует ввести в брюшную полость 500 000 ЕД Ронколейкина, разведенного в 10 мл физиологического раствора. На 2-е, 4-е, 8-е, 12-е, 16-е, 20-е, 24-е, 28-е сутки послеоперационного периода внутривенно вводить по 500 000 ЕД Ронколейкина, разведенного в 400 мл физиологического раствора, в течение 3-4 часов. Для предотвращения потери биологической активности препарата при длительности инфузии более 4 часов во флакон с Ронколейкином целесообразно вводить 6 мл 10 % человеческого сывороточного альбумина. Таким образом, лечение Ронколейкином продолжается в течение 1 месяца, а курсовая доза препарата составляет 4 500 000 ЕД.


загрузка...