Клинико-экспериментальное обоснования использования иммуномодуляторов в комплексной терапии наружного генитального эндометриоза (30.03.2009)

Автор: Павлов Роман Владимирович

Определить продукцию цитокинов (ИЛ1?, ИЛ2, ИЛ4, ИЛ6, ИЛ8, ФНО?, ИФН?) мононуклеарными клетками периферической крови и перитонеальной жидкости больных НГЭ, а также уровень этих цитокинов в нативной перитонеальной жидкости и ткани эндометриоидных гетеротопий в зависимости от пролиферативной активности клеток эктопического эндометрия.

Оценить эффективность рекомбинантного интерферона-(2 и интерлейкина-2 в терапии экспериментального эндометриоза у крыс. Изучить влияние этих препаратов на пролиферативную активность эпителия очагов экспериментального эндометриоза, степень их васкуляризации, особенности лейкоцитарной инфильтрации и клеточного состава перитонеальной жидкости экспериментальных животных.

Оценить ближайшие (течение послеоперационного периода и иммунокоррегирующий эффект) и отдаленные (клинический эффект, снижение уровня СА125, наступление беременности и рецидива заболевания) результаты противорецидивной терапии НГЭ интерфероном-?2b (Реафероном-ЕС) и генноинженерным аналогом эндогенного интерлейкина-2 (Ронколейкином) в клинике.

Научное значение настоящего исследования. Изучены показатели общего и местного иммунитета у больных НГЭ, особенности цитокинового обмена и активность ангиогенеза в эндометриоидных гетеротопиях в зависимости от пролиферативной активности клеток их эпителия. Подтверждена роль иммунной системы и ангиогенеза в возникновении и прогрессировании НГЭ, выявлены возможные точки приложения селективной иммунотерапии для профилактики рецидивов заболевания. Впервые в эксперименте in vivo изучена эффективность и механизм действия интерферона-(2 и генноинженерного аналога эндогенного интерлейкина-2 (ИЛ2) в отношении экспериментального эндометриоза у крыс. Предложена патогенетически обоснованная и экспериментально подтвержденная комплексная схема лечения наружного генитального эндометриоза с использованием интерферона-?2 (Реаферона-ЕС) и генноинженерного аналога эндогенного интерлейкина-2 (Ронколейкина), проведена оценка ее эффективности. Доказано, что предлагаемые схемы селективной иммунотерапии НГЭ улучшают течение послеоперационного периода, в отношении противорецидивного и клинического эффекта не уступают гормональной терапии с использованием агонистов ГнРГ, не обладая побочными эффектами последней, а в отношении восстановления фертильности у больных с бесплодием превосходят общепринятую схему лечения в два раза.

Теоретическое и практическое значение результатов работы. Полученные иммунологические и морфологические данные углубляют имеющиеся сведения о роли иммунной системы и ангиогенеза в патогенезе наружного генитального эндометриоза. Полученные экспериментальные данные расширяют представления о механизме действия цитокинов в отношении регресса очагов эндометриоза и обосновывают целесообразность использования селективной иммунотерапии в комплексном лечении этого заболевания. Полученные клинические данные позволяют предлагать к широкому применению эффективные и безопасные схемы комплексного лечения наружного генитального эндометриоза с использованием селективной иммунотерапии, не уступающие по эффективности общепринятым методам, а по восстановлению фертильности у больных с бесплодием превосходящие их в два раза.

Апробация работы и внедрение результатов в практику. Основные результаты исследований вошли в отчет по научно-исследовательской работе Ставропольской государственной медицинской академии и ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН за 2005 – 2008 гг. Материалы исследований используются в учебном процессе при чтении лекций, проведении лабораторно-практических занятий и научных исследований в Ставропольской государственной медицинской академии и в ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН.

Основные положения работы доложены на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные аспекты жизнедеятельности человека на севере» (Архангельск, 2006), на итоговых конференциях молодых ученых и студентов Ставропольской государственной медицинской академии (Ставрополь, 2006, 2007, 2008), на краевой клинической конференции акушеров-гинекологов (Ставрополь, 2007, 2008), на 9-м Всероссийском научном форуме «Мать и дитя» (Москва, 2007), на 3-м Международном научном конгрессе «Новые технологии в акушерстве и гинекологии» (Ст-Петербург, 2007), на II-м региональном научном форуме «Мать и дитя» (Сочи, 2008), на Объединенном иммунологическом форуме (Ст-Петербург, 2008), на III-м международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2009).

Предлагаемая схема лечения НГЭ применяется на практике в гинекологических отделениях Ставропольского краевого клинического перинатального центра и Ставропольского краевого клинического центра специализированных видов медицинской помощи.

Основные положения диссертации изложены в 21 научной работе (11 из них опубликованы в изданиях, входящих в перечень ВАК РФ), в практических рекомендациях, а также в материалах российских и международных конференций и форумов.

Основные положения, выносимые на защиту

Клинические проявления наружного генитального эндометриоза и частота ассоциированного с ним бесплодия определяются не только степенью распространения заболевания, но и пролиферативной активностью эпителия эндометриоидных гетеротопий.

Пролиферативная активность эпителия эндометриоидных гетеротопий находится в прямой зависимости от степени их васкуляризации, активности перитонеальных макрофагов и уровня провоспалительных цитокинов в перитонеальной жидкости и ткани гетеротопий.

Лечение экспериментального эндометриоза у крыс с применением монотерапии интерфероном-( и генноинженерным аналогом ИЛ2 ведет к полному регрессу очагов эндометриоза более чем в половине случаев.

В основе регресса очагов эндометриоза на фоне проводимой селективной иммунотерапии лежит увеличение активности Т-лимфоцитов и естественных киллеров при одновременном снижении активности макрофагов и степени васкуляризации эндометриоидных гетеротопий.

Селективная иммунотерапия, включенная в комплексное лечение наружного генитального эндометриоза, улучшает течение послеоперационного периода, не отличается по противорецидивному и клиническому эффекту от терапии НГЭ агонистами ГнРГ, не обладает побочными эффектами последних, позволяет в 3 раза снизить частоту возникновения спаечного процесса малого таза после хирургического вмешательства, в 2 раза увеличить частоту наступления беременностей у пациенток с бесплодием и значительно снизить себестоимость лечения больных.

Структура и объем диссертации. Диссертация включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, пять глав собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения и список литературы, содержащий 103 работы отечественных и 372 работы зарубежных авторов. Диссертация изложена на 290 страницах машинописного текста. Работа иллюстрирована 91 таблицей, 34 фотографиями и 5 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Общее количество больных НГЭ, находившихся под нашим наблюдением с 1999 по 2008 гг., составило 835 человек. С целью подбора клинически однородной группы для проведения основной части исследования всем больным проводилось общеклиническое обследование и лечебно-диагностическая лапароскопия. Клиническое обследование больных включало в себя сбор анамнеза, проведение гинекологического исследования, УЗИ органов малого таза, определение в периферической крови уровня СА125. Лечебно-диагностическая лапароскопия проводилась с помощью оборудования фирмы «Karl Storz» (Германия). Степень распространения НГЭ определялась в баллах по пересмотренной классификации Американского общества фертильности r-AFS.

На основании полученных клинических и эндоскопических данных было отобрано 150 больных НГЭ, сопоставимых по возрасту, жалобам, анамнезу, гинекологической и экстрагенитальной патологии, у которых проводилось морфометрическое исследование удаленных очагов эндометриоза и иммунологическое исследование периферической крови (ПК), перитонеальной жидкости (ПЖ) и ткани эндометриоидных гетеротопий.

В ходе изучения пролиферативной активности клеток эктопического эндометрия, степени васкуляризации и характера лейкоцитарной инфильтрации все очаги ЭБ были разделены на три группы: I группа – 30 гетеротопий «красного» цвета, II группа – 44 гетеротопии «черного» цвета, III группа – 26 гетеротопий «белого» цвета. Эндометриоидные кисты яичников (ЭКЯ) в зависимости от их микроскопического строения были разделены на две группы: I группа – железисто-кистозный вариант (ЖКВ) (35 препаратов) и II группа – кистозный вариант (КВ) (45 препаратов).

Для проведения морфологического исследования гистологические препараты, фиксированные в 10 % нейтральном формалине и 96 % охлажденном этаноле, окрашивались гематоксилином-эозином, по Ван-Гизону, Романовскому-Гимзе, акридиновым оранжевым и азотнокислым серебром. Системный морфометрический анализ удаленных препаратов выполнялся с помощью микротелефотометрического анализатора изображения с использованием программы «ВидеоТест-Морфо» («Истра-ВидеоТест», Россия).

Пролиферативная активность клеток эктопического эндометрия и эндотелия капилляров оценивалась на основании критериев, предложенных Г.Г. Автандиловым (1996): высота эндометриоидных клеток, средняя площадь ядер эндометриоидных и эндотелиальных клеток, плотность распределения ДНК в ядрах клеток, параметры активности областей ядрышковых организаторов (ОЯОР) (среднее количество, средняя площадь, суммарная площадь ОЯОР в ядре клетки). Степень васкуляризации очагов эндометриоза оценивалась на основании подсчета процента площади просвета сосудов в 1 мм2 образца ткани, средней площади просвета капилляра и показателей пролиферативной активности эндотелиальных клеток капилляров. В лейкоцитарных инфильтратах очагов ЭБ и ЭКЯ подсчитывалось количество нейтрофилов, эозинофилов, плазматических, тучных клеток, лимфоцитов и макрофагов.

Перед проведением иммунологического исследования все больные II – III степени распространения НГЭ (100 женщин) в зависимости от степени пролиферативной активности эктопического эндометрия гетеротопий были разделены на две группы: I группа – 30 больных с высокой пролиферативной активностью клеток эндометриоидных гетеротопий и II группа – 70 больных с низкой пролиферативной активностью клеток эктопического эпителия. Контрольную группу составили 30 женщин репродуктивного возраста, без признаков НГЭ и сопутствующей гинекологической патологии, с двухфазным менструальным циклом, поступивших для выполнения хирургической стерилизации.

Объем иммунологического исследования включал: изучение относительного и абсолютного количества основных субпопуляций иммунокомпетентных клеток в ПК и ПЖ (CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD25 – лимфоциты) методом проточной цитометрии на проточном цитометре Bio Rad («Brute-HS», США), с использованием антител, конъюгированных с флуоресциинизотиоционатом (FITC) и фикоэритрином (PE) («Caltag Laboratories», США). Изучение продукции ИЛ1(, ИЛ2, ИЛ4, ИЛ6, ИЛ8, ФНО(, ИФН( изолированными МНК ПК и ПЖ, тканью эндометриоидных гетеротопий in vitro, а также определение уровня этих цитокинов в нативной ПЖ осуществлялось методом твердофазового иммуноферментного анализа (ИФА) на планшетном фотометре «Labsystems iEMS Reader MF» (Финляндия) с использованием наборов «ВекторБест» и «Протеиновый контур» (Россия) согласно прилагаемым к наборам методикам.

Перед использованием селективной иммунотерапии НГЭ в клинике, с целью оценки ее эффективности и безопасности, а также для уточнения возможного механизма действия, предлагаемая схема с применением рекомбинантного крысиного интерферона-?2 и генноинженерного аналога ИЛ2 (Ронколейкина) была апробирована в эксперименте in vivo на 40 крысах линии Vistar с моделированным экспериментальным эндометриозом (ЭЭ). В качестве контрольной группы использовались 20 животных с ЭЭ, не получавших специфического лечения.

Модель ЭЭ была воспроизведена путем аутотрансплантации фрагментов левого маточного рога на внутреннюю поверхность передней брюшной стенки. Через 10 дней после трансплантации маточного рога все животные были разделены на 3 группы: I группе (20 животных) в асептических условиях в брюшную полость вводился генно-инженерный аналог ИЛ2 «Ронколейкин» («Биотех», Россия), в дозировке 8 000 ЕД на 1 кг, трехкратно, с интервалом через 1 день; II группе (20 животных) в асептических условиях в брюшную полость вводился рекомбинантный крысиный (2-интерферон («Sigma-Aldrich», США), в дозировке 15 000 ЕД на 1 кг, трехкратно, с интервалом через 1 день; III группе (20 животных) в асептических условиях в брюшную полость по обозначенной схеме вводился стерильный физиологический раствор.

Оценка эффективности проводимой терапии ЭЭ осуществлялась через 40 дней от начала эксперимента на основании сравнения следующих морфологических критериев: наличие эндометриоидных желез в трансплантате, объем трансплантата, площадь эндометриоидных желез, пролиферативная активность клеток эндометриоидного эпителия.

Кроме этого, с цель уточнения возможного механизма действия селективной иммунотерапии на очаги ЭЭ оценивались: клеточный состав ПЖ, степень васкуляризации очагов ЭЭ, интенсивность и состав лейкоцитарной инфильтрации очагов ЭЭ.

После апробации селективной иммунотерапии в эксперименте была проведена оценка эффективности интерферона-?2b (Реаферона-ЕС, «Вектор-Медика», Россия) и генноинженерного аналога ИЛ2 (Ронколейкина, «Биотех», Россия) у 80 больных НГЭ, составивших основную группу. В качестве группы сравнения использовались 40 больных НГЭ, получавших в послеоперационном периоде агонист ГнРГ (Бусерелин-депо, ЗАО «Фарм-Синтез», Россия).

Все больные основной и контрольной группы были сопоставимы по возрасту, анамнезу, предъявляемым жалобам, данным иммунологического исследования ПК, объему хирургического вмешательства и равноценности общего медикаментозного комплекса. У всех больных диагноз НГЭ был подтвержден гистологически. Обязательным условием включения больных в эксперимент было предварительное удаление очагов эндометриоза во время выполнения лечебно-диагностической лапароскопии, а также отсутствие у них аутоиммунных заболеваний и аллергических реакций.

После удаления очагов НГЭ все больные были разделены на две основные и контрольную группу: I группе (40 больных) после хирургического удаления очагов НГЭ в брюшную полость вводился Ронколейкин в количестве 500 000 ЕД. В дальнейшим этим больным Ронколейкин вводился на 2-е, 4-е, 8-е, 12-е, 16-е, 20-е, 24-е, 28-е сутки после операции внутривенно, капельно в количестве 500 000 ЕД на одно введение. Таким образом, курс лечения Ронколейкином составлял 1 месяц, а суммарная доза препарата 4 500 000 ЕД. II группе (40 больных) после хирургического удаления очагов НГЭ в брюшную полость вводился Реаферон-ЕС в количестве 1 000 000 ЕД. В дальнейшим этим больным Реаферон-ЕС вводился на 2-е, 4-е, 7-е, 10-е, 13-е, 16-е, 19-е, 22-е, 25-е, 28-е сутки после операции внутримышечно, в количестве 1 000 000 ЕД на одно введение. Таким образом, курс лечения Реафероном-ЕС составлял 1 месяц, а суммарная доза препарата 11 000 000 ЕД. III контрольной группе (40 больных) после хирургического удаления очагов НГЭ получали «Бусерелин-Депо», каждые 28 дней по 3,75 мг внутримышечно в течение 6 месяцев.

Оценка эффективности терапии НГЭ проводилась по следующим критериям: иммунокорригирующий эффект (иммунограммы ПК через 1 и 6 месяцев после операции); особенности течения послеоперационного периода; наличие осложнений, связанных с применением иммунокорригирующий и гормональной терапии (в течение 1 и 6 месяцев соответственно); клинический эффект в отношении болевого синдрома, нарушений менструального цикла, психоэмоциональной сферы и уровня СА125 в периферической крови на протяжении 12 месяцев наблюдения после завершения противорецидивной терапии НГЭ; частота наступления беременностей у пациенток с бесплодием в течение 12 месяцев после завершения иммунокорригирующей и гормональной терапии; наличие рецидива НГЭ по данным контрольной лапароскопии, выполняемой в случае отсутствия беременности через 12 месяцев после завершения иммунокорригирующей и гормональной терапии.

Статистическая обработка полученных данных проводилась на компьютере PENTIUM IV с использованием программ «Primer Biostatistic 4.03. for Windows» и «Microsoft Excel 97 for Windows». Для всех изучаемых показателей определялось среднее значение и ошибка среднего; сравнение качественных параметров в исследуемых группах проводилось с помощью непараметрических методов (2, (2 с поправкой Йетса; сравнение количественных показателей – с помощью критерия Манна-Утни и Стьюдента, сравнение показателей до и после лечения проводилось с помощью критерия Вилкоксона. Критерием статистической достоверности получаемых выводов считали общепринятую в медицине величину р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Клиническая и эндоскопическая характеристика больных наружным генитальным эндометриозом

В ходе проведения лапароскопического вмешательства было установлено, что наиболее часто эндометриоидные гетеротопии локализовались на брюшине маточно-прямокишечного углубления (68,9 %), крестцово-маточных связках (59,3 %) и яичниках (71,7 %). Сочетание различных локализаций эндометриоидных очагов при НГЭ наблюдалось в 86,7 % случаев, у 7 пациенток был диагностирован эндометриоз толстого кишечника. В 64,8 % случаях ЭБ сочетался с ЭКЯ, у 312 (37,4 %) больных был выявлен выраженный спаечный процесс в малом тазу.

Макроскопически эндометриоидные гетеротопии выглядели в виде петехий, пузырьков, папул и пятен. Размеры поверхностных гетеротопий варьировали от 1 до 5 мм в диаметре. Для инфильтративных форм были характерны более обширные поражения и инвазивный рост в подбрюшинную клетчатку.

Несмотря на большое разнообразие визуальных проявлений НГЭ, в зависимости от цвета очаги ЭБ и яичников можно было условно разделить на «белые», «красные» и «черные», а также их различные сочетания. Среди монохромных очагов ЭБ наиболее часто встречались «черные» (30,5 %), на втором месте по частоте распространения были «красные» (10,9 %) очаги, и наиболее редко встречались гетеротопии «белого» (1,6 %) цвета. Среди комбинаций очагов эндометриоза разного цвета наиболее часто встречалось сочетание «красных» и «черных» (26,8 %) и «черных» и «белых» (20,6 %) гетеротопий. Комбинации «красных», «черных» и «белых» (8,26 %), а также «красных» и «белых» очагов (1,3 %) встречались достаточно редко.

При определении проходимости маточных труб у пациенток с бесплодием, ассоциированным с НГЭ, было установлено, что отсутствие проходимости обеих маточных труб наблюдалось только в 23,3 % случаев. В 26,8 % случаев была непроходима только одна маточная труба, а в 49,8 % обе маточные трубы были проходимы.


загрузка...