Создание и использование новых биопрепаратов для деструкции органических отходов и повышения сохранности животных (29.06.2012)

Автор: Иванов Александр Аркадьевич

Bacillus subtilis- в препарате из агаровых или бульонных культур - округлые, грамположительные спорообразующие палочки, размерами: 5,0±0,10 мкм и 5,0±0,1 мкм. В мазках клетки располагаются по отдельности изолировано или скоплениями в виде коротких цепочек.

Candida krusei на агаровых и бульонных культурах представляет собой округлые, грамположительные дрожжевые клетки, размерами: 4,0 ± 0,17 мкм и 5,0 ± 0,3 мкм. В мазках клетки располагаются по отдельности изолировано или скоплениями в виде цепочек.

При исследовании морфологических свойств штамма Actinomyces fradiae на сусло–агаре отмечено образование мелких (1-2 мм), кремоватого цвета, выпуклых, вязкой консистенции, мутных колоний с гладкой поверхностью и ровными краями (S-формы колоний). В жидкой питательной среде (МПБ) рост Actinomyces fradiae характеризовался помутнением, с формированием слизистой пленки, легко разбивающейся при встряхивании.

На сусло-агаре рост клеток Bacillus subtilis-99 характеризовался образованием пленки на питательной среде, округлой формы колоний, мутных, кремового цвета, с ровными краями. Клетки вызывали помутнение МПБ, с формированием слизистой пленки и хлопьев, разбивающиеся при встряхивании. На твердой среде (МПА) образует плоские, непрозрачные блестящие колонии бежевого цвета с неровными краями в диаметре около ? 2-3 мм.

На сусло-агаре рост дрожжевых клеток Candida krusei характеризовался образованием мелких (1 мм), округлой формы колоний, мутных, кремового цвета, с ровными краями и вязкой консистенции. Дрожжевые клетки вызывали помутнение МПБ, с формированием слизистой пленки и хлопьев, разбивающиеся при встряхивании.

В результате проведенных исследований было установлено, что сахаролитическая активность Actinomyces fradiae хорошо выражена: на средах Гисса интенсивно ферментирует с образованием кислоты без газа глюкозу, сахарозу, глицерин, маннит, дульцит, лактозу; а с образованием кислоты и газа - мальтозу. Bacillus subtilis-99 на средах Гисса ферментирует мальтозу с образованием кислоты и газа. С образованием только кислоты расщепляет глюкозу, сахарозу, глицерин, маннит, сорбит, дульцит, лактозу, амилазу.

Исследуемые штаммы обладают протеолитической активностью, об этом свидетельствует разжижение всего столбика желатина, находящегося в пробирке.

Actinomyces fradiae–96, Bacillus subtilis-99 и Candida krusei-96 обладают каталазной и уреазной активностью. Не образуют индол и сероводород.

При нанесении на поверхность агара раствора Люголя наблюдалось образование бесцветной зоны вдоль штриха, образующейся в результате расщепления крахмала, что позволяет сделать вывод о том, что исследуемые штаммы обладают амилолитической активностью.

Actinomyces fradiae–96, Bacillus subtilis-99 и Candida krusei-96 не патогенны для животных. Исследуемые штаммы не вызывали гибели белых мышей при подкожном и внутрибрюшинном введении взвеси культуральной массы в объеме 0,5 см3, с содержанием в 1 см3 50, 100, 250, 500 млн., 1 и 2 млрд. мкр. клеток. При вскрытии вынужденно убитых животных видимых изменений во внутренних органах не наблюдалось. Из тканей внутренних органов убитых животных исходная культура не выделялась.

Штаммы паспортизированы как:

1. Actinomyces fradiae-96-ВГНКИ 04.05.17.-ДЕП, депонирован 10.08.2004 во «Всероссийском государственном центре качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов». Справка о депонировании штамма выдана за № 2395/20 от 23.09.2004.

2. Bacillus subtilis-99 –ДЕП и депонирован 22.09.2004 и во ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» под № 2/04.

3. Candida krusei-96 – ВГНКИ 04.05.18.-ДЕП и депонирован 23.09.2004 во «Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве» (ФГУ ВГНКИ). Справка о депонировании штамма выдана за № 2396/20 от 23.09.2004.

3.2 Определение показателей безопасности ускорителя

ферментации «Экос»

3.2.1 Острая и субхроническая токсичность

ускорителя ферментации

Острую токсичность ускорителя ферментации изучали в опытах на 50 белых мышах (массой 18-20 г) и 40 крысах (массой 150-160 г) обоего пола, разделенных по принципу аналогов на опытные и контрольные группы.

Животным опытных групп однократно внутрижелудочно вводили ускоритель ферментации дозе 0,5 см3 для белых мышей и 5 см3 для крыс. Препарат вводили как в нативном состоянии (1 группа), так и в рабочем растворе, то есть раствор ускорителя ферментации в концентрации 1:1000 (2 группа). При этом содержание микробных клеток в 1 см3 ускорителя ферментации составило 250 млн. микр. клеток, раствора – 250 тыс. микр. клеток. Таким образом, мышам вводили в концентрации 100 млн. микр. клеток (препарат) и 100 тыс. микр. клеток (раствор), крысам соответственно 1 млрд. микр. клеток и 1 млн. микр. клеток в см3. Животным контрольных групп в аналогичном объеме вводили физиологический раствор.

Проведенные опыты показали, что однократное внутрижелудочное введение препарата не вызывало гибели животных и существенных отклонений от нормального физиологического состояния. Поскольку дозы 0,5 и 5 см3 являются максимально вводимыми при внутреннем введении соответственно белым мышам и белым крысам, то большие дозы ускорителя ферментации не вводили. Вследствие этого ЛД50 препарата установить не удалось.

Субхроническую токсичность ускорителя ферментации оценивали на 30 белых крысах обоего пола с начальной массой 150-160 г., разделенных по принципу аналогов на 3 группы по 10 голов в каждой. Подопытным животным ускоритель ферментации вводили внутрижелудочно в нативном виде (1 группа) и в рабочем растворе (2 группа). В связи с невозможностью определения ЛД50, первоначально вводимая доза в первые 4 сут составила 0,5 см3, то есть 1/10 от максимальной вводимой. В последующие 4 сут дозу увеличивали в 1,5 раза, что составило 0,75 см3; спустя 4 сут предыдущую дозу вновь увеличивали в 1,5 раза (1,5см3) и так до окончания эксперимента (24 сут).

Контрольным животным по аналогичной схеме вводили физиологический раствор. Таким образом, суммарная вводимая доза в первые 4 сут составила 2 см3, последующие – 3; 4,5; 6,8; 10 и 15,2 см3, соответственно. Суммарно вводимая доза в течение всего периода эксперимента составила 41,5 см.3

Ежедневное внутрижелудочное введение препарата не вызвало гибели животных опытных групп и существенных отклонений от нормального состояния. Животные всех групп сохраняли удовлетворительный аппетит, имели гладкий и чистый шерстный покров.

В течение эксперимента у животных всех групп наблюдалось постепенное увеличение массы тела. Так, при многократном введении как нативного ускорителя ферментации, так и раствора в концентрации 1:1000 в возрастающих дозах у животных 1 и 2 группы на 10 сут отмечалось увеличение живой массы в среднем на 13,9 (Р<0,001) и 11,7 % (Р<0,05) соответственно. На 20 сут опыта прирост массы тела у животных этих групп составил соответственно 23,6 (Р<0,001) и 22,0 %. В конце опыта (на 24 сут) живая масса подопытных крыс увеличилась в среднем на 28,4%(Р<0,01) и 33,8% (Р<0,001).

У контрольных животных отмечался более низкий прирост массы тела, который составил на 10 сут – 10,1, на 20 сут – 20,2 и на 24 сут – 25,7% соответственно.

Гематологические и биохимические показатели крови крыс при многократном введении ускорителя ферментации находились в пределах физиологической нормы.

Однократное и многократное внутрижелудочное введение ускорителя ферментации как в рабочем растворе, так и в нативном состоянии не вызывает гибели лабораторных животных. Данное обстоятельство не позволило определить лд50 и рассчитать коэффициент кумуляции по показателю «смертельный эффект». Однако, можно предположить, что коэффициент кумуляции (отношение максимально вводимой дозы при многократном введении на максимально вводимую дозу при однократном введении) составляет 8,3 и по классификации Медведь Л.И. (1986) ускоритель ферментации можно отнести к веществам не обладающим кумулятивным действием.

3.2.2 Изучение хронической токсичности

ускорителя ферментации «Экос» на белых крысах

Длительное действие препарата, а также влияние его на энергию роста, гематологические и биохимические показатели крови изучали в опытах на белых крысах, разделенных на 4 группы, по 10 животных в каждой. Крысы 1 группы в течение 3 мес получали вместо питьевой воды 16%-ный водный раствор ускорителя ферментации, 2 группы – 8% раствор ускорителя ферментации, 3 группы – 4%-ный раствор ускорителя ферментации. Содержание микробных тел составило в 1 см3 данного раствора соответственно 32, 16 и 8 млн. микр. клеток.

Контрольная (4) группа крыс по аналогичной схеме получала физиологический раствор.

Крысы первой опытной группы по сравнению с контролем быстрее набирали в весе. Так, через 1,2 и 3 мес прирост живой массы составил 88; 84,8 и 21,4%, тогда как в контроле – 81,1; 69,9 и 18,3% соответственно.

Проведенные исследования крови показали, что существенной разницы у крыс контрольной и опытных групп в гематологических и биохимических показателях не обнаружено.

При диагностическом вскрытии изменений в органах сердечно-сосудистой системы, желудочно-кишечного тракта и мочевыводящих путей не обнаружено.

При микробиологическом исследовании печени, почек, желудка, сердца и селезенки исходные культуры ускорителя ферментации не выделены.

Таким образом, в острых и хронических экспериментах на лабораторных животных установлена безвредность ускорителя ферментации «Экос» и согласно гигиенической классификации он относится к малотоксичным препаратам, по ГОСТ – 4-му классу – вещества малоопасные. Полученные данные позволяют отнести ускоритель ферментации к безвредным препаратам, не обладающим кумулятивным действием.

Многократное внутрижелудочное введение ускорителя ферментации не оказывало отрицательного влияния на функциональное состояние центральной нервной системы, на антитоксическую функцию печени и на поведенческие реакции животных. Так, при рассмотрении показателей двигательной активности число пересечений в опытной и контрольной группах было 38,2±1,1 и 37,4±0,13 (Р(0,05). Исследовательская активность у подопытных животных составила 9,8±0,30 и 8,5±0,57 (Р(0,05) заглядываний.

Тест учета длительности восстановления способности к прямолинейному движению после вращения демонстрирует эффективность ускорителя ферментации «Экос» повышать адаптацию вестибулярного аппарата к перегрузкам и увеличение статической физической выносливости. Так, длительность висения мышей опытной группы составила 25,8±0,5, а в контроле 21,6±0,5 минут.

Ускоритель ферментации «Экос» достоверно увеличивает время жизни мышей, при этом стабилизировались показатели перекисного окисления липидов (снижались уровни малонового диальдегида и гидроперекисей липидов мозга) и восстанавливалась антиокислительная (каталазная) активность, что свидетельствует об увеличении резервной антиокислительной активности мозга.


загрузка...