Создание и использование новых биопрепаратов для деструкции органических отходов и повышения сохранности животных (29.06.2012)

Автор: Иванов Александр Аркадьевич

Биологическую оценку культур проводили с учетом определения морфологических (форма, размеры клеток), тинкторальных (способность к окраске анилиновыми красителями), физиологических (характер роста культур на жидких и плотных питательных средах, ферментации углеводов и многоатомных спиртов, уреазная и каталазная активность, образование конечных продуктов белков) и патогенных свойств. Морфологические и тинкторальные свойства штаммов устанавливали путем микроскопирования мазков из агаровых или бульонных культур, окрашенных по Граму.

Размеры микроорганизмов определяли с помощью световой микроскопии с использованием окулярного микрометра АМ 9-2, при этом высчитывали среднее арифметическое значение от измерения 20 клеток.

Для культивирования микроскопических грибов использовали поверхностный и глубинный методы.

Культуральные свойства микроорганизмов изучали по характеру их роста в жидких (МПБ) и на плотных (сусло-агар) питательных средах, после инкубирования посевов в термостате в течение 24-48 ч, при температуре 370С. Посевы на плотных питательных средах просматривали как невооруженным глазом, так и под световым микроскопом «Биолам», определяя их размеры, форму, характер краев, прозрачность, консистенцию колоний. Характеризовали рост микроорганизмов в жидких питательных средах, учитывали наличие пленки, осадка, степень помутнения МПБ.

При изучении биохимических свойств штаммов использовали: МПБ с индикаторными бумажками, пропитанными уксусно-кислым свинцом (определение сероводорода), реактив Эрлиха (выделение индола); среды Гисса содержащие различные углеводы и многоатомный спирт; агар Кристенсена (уреазная активность); МПЖ (протеолитическая активность); МПА с 0,2%-ным растворимым крахмалом (амилолитическая активность). Каталазную активность микромицетов изучали путем суспендирования культуральной массы в 3%-ной перекиси водорода на предметном стекле. Кроме этого, каталазную активность тестировали непосредственно у выросших культур на сусло-агаре. Для этого на поверхность культуры на скошенном агаре наносили несколько капель 3%-ной перекиси водорода. Наличие каталазы оценивали по появлению пузырьков газа (атомарный кислород, отщепленный каталазой от перекиси водорода).

Патогенные свойства Actinomyces fradiae-96, Bacillus subtilis-99 и Candida krusei-96 изучали путем подкожного и внутрибрюшинного введения белым мышам 0,5-1 см3 взвеси микроорганизмов в МПБ, с содержанием в 1 см3 100, 250, 500 млн. 1 и 2 млрд. микр. клеток.

Исследования проводили на лабораторных (белые мыши, крысы, морские свинки, кролики) и сельскохозяйственных (коровы, подсвинки) животных, содержащихся в условиях вивария ФЦТРБ-ВНИВИ и хозяйствах Кукморского района (СХП «им. Вахитова» и «Рассвет»). Перед проведением каждого опыта - животных, по принципу аналогов (живая масса, возраст, пол), делили на опытные и контрольные группы. Кормление и содержание животных опытных групп не отличалось от контрольных.

Изучение острой, хронической токсичности, кумулятивного, раздражающего и аллергизирующего действий, пирогенных, канцерогенных и эмбриотоксических свойств препарата проводили согласно «Руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (М., 2005) и «Методических указаний по определению токсических свойств препаратов, применяемых в ветеринарии и животноводстве» (М., 1988, 2008).

Острую токсичность ускорителей ферментации оценивали на белых мышах и белых крысах. Препарат вводили в желудок атравматическим зондом однократно как в виде рабочего раствора, так и в нативном виде.

Через 7 сут после введения ускорителя ферментации по 5 животных из каждой группы убивали декапитацией с предварительным эфирным наркозом. После убоя проводили диагностическое и микробиологическое исследования внутренних органов.

Изучение влияния ускорителя ферментации на функциональное состояние печени проводили с использованием гексеналовой пробы и определения активности гепатоспецифических ферментов. Активность аспартатаминотрансферазы (АсАТ) и аланинаминотрансферазы (АлАТ) в сыворотке крови определяли вначале методом Рейтмана-Френкеля (Кондрахин И.П. и др., 2004), в дальнейшем с помощью биохимического анализаторов EXPRES PLUS» и «Microlab 200».

Функциональное состояние нервной системы при многократном воздействии ускорителя ферментации оценивали в опытах на белых крысах, с использованием тест-метода «открытое поле», предложенного Boissier O.R. et al. (1964).

Физико-химический анализ воды проводили согласно СанПиН 1074-01. Определение содержания тяжелых металлов в воде и органических отходах проводилось атомно-абсорбционным методом на ААС Perken Elmer «AAnalyst 200» по ГОСТ 30178-96. Пробоподготовку проводили согласно ГОСТ 26929-94. Содержание ртути определяли методом типа «холодного пара» на анализаторе «Юлия-5К» по ГОСТ 51212-98, мышьяка – колометрическим методом по ГОСТ 26930-86.

Определение пестицидов в навозе/помете, воде определяли с помощью газожидкостной хроматографии на хроматографах Дименшин-1 (США), Кристалл-5000 (Россия, США), диоксинов - с помощью тандемной ГЖХ и хроматомассспектрометрии на приборах Хиттачи (Япония) и Финиган (США).

Для выявления тератогенного эффекта опытных животных убивали в конце беременности. Послойную оценку макроструктуры внутренних органов проводили по методу Willson (1965) в модификации отдела эмбриологии ИЭМ АМН СССР; изучение развития скелета - по методу Dawson (1926).

В ходе экспериментов определяли гематологические и биохимические показатели крови, регистрировали прирост массы тела животных. Количество эритроцитов, лейкоцитов, гемоглобина, СОЭ определяли по общепринятым методам (Кудрявцев А.А., Кудрявцева Л.А., 1974), глюкозы – ортотолуидиновым методом, общего белка – рефрактометрически (Антонов Б.И. и др., 1991).

Обеззараживающее действие ускорителя ферментации изучали на экспериментально контаминированном органическом субстрате (свиной навоз). Для контаминации субстрата использовали музейные штаммы микроорганизмов: Escherichia coli 0126 и Salmonella typhimurium 371. До и каждые 5 сут после обработки навоза ускорителем ферментации подсчитывали количество микроорганизмов в субстрате методом серийного разведения.

Производственные опыты по изучению эффективности ускорителя ферментации для переработки навоза и помета проведены в условиях свиноводческих, скотоводческих и птицеводческих хозяйств РФ. Использовались различные дозы препарата, ставились опытные и контрольные пробы. До и после обработки навозных масс отбирали пробы (как с поверхности, так и с глубины) для проведения микробиологических, копрологических, токсикологических и химических исследований. Для выделения и количественного учета микроорганизмов образцы навоза высевали в виде разведенной суспензии на питательные среды разного состава, в чашках Петри. Культивирование осуществлялось в условиях термостата, а затем проводился подсчет и микроскопический анализ выросших колоний. С целью выявления в отобранных образцах яиц гельминтов, исследование фекалий проводили методом Фюллеборна (Шевцов А.А. и др.,1973).

По окончании процесса ферментации проводили анализ качества получаемого удобрения и качества воды в соответствии с ГОСТ. Качество получаемого удобрения оценивалось по содержанию основных питательных веществ. Определение влаги проводили по ГОСТ 26713-85, общего азота по ГОСТ 26715-85, общего фосфора в пересчете на Р2О5 и общего калия в пересчете на К2О по ГОСТ 26717-85.

Из сравнительных нагрузочных тестов использовались модели антагонизма с гексеналом (антинаркозное действие) по продолжительности гексеналового сна (Брехман И.И., 1957), учет длительности восстановления способности к прямолинейному движению после вращения по Васильеву К.Г. (1957), максимальной длительности статической работы (удержание белыми мышами своего тела на вертикальной сетке), длительности плавания мышей с грузом (динамической работы), содержание малонового деальдегида по Е.Н. Гончаренко, А.М. Латиновой, (1985). Из моделей экстремальных факторов использовали моделирование гипоксии в замкнутом объеме («баночная гипоксия») (Кигель Г.Б., Хабарджахьян А.В., 1978).

Содержание сульфгидрильных групп сыворотки крови – амперомет-рическим титрованием по Рубиной Н.С. (Кост С.А., Стенко М.И., 1974).

В экспериментальной работе использовали 224 белых мышей, 320 белых крыс, 24 морских свинок, 32 кролика, 260 проб крови, 520 проб навоза, помета, 40 образцов нефти, 20 – нефтешламов, 120 – сточных вод. Проведено более 2000 микробиологических, копрологических, гематологических, биохими-ческих и хроматографических исследований.

Экономические расчеты проводили с учетом вероятного экономического ущерба и экономической эффективности (Никитин И.Н., 2008, 2011).

Цифровой материал подвергали статистической обработке на персональ-ном компьютере по общепринятым методам вариационной статистики с вычислением средней арифметической (М), ошибки средней арифметической (±m), критерия достоверности Стьюдента (t) и коэффициента корреляции (r) с использованием программы Microsoft Excel.

При выполнении отдельных этапов работ принимали участие зав. сектором, с.н.с., к.б.н. Матросова Л.Е., вед. инженер Мохтарова С.Л., с.н.с., к.б.н. Конюхова В.А., за что выражаем им признательность.

Библиографическое описание использованных в диссертации литератур-ных источников осуществляли в соответствии с требованиями действующего ГОСТа.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 изучение биологических свойств культур

микроорганизмов, входящих в состав ускорителя

ферментации органических отходов, их паспортизация

Для создания препаратов, обладающих биодеструктивными свойствами, были использованы культуры микроорганизмов B.subtilis-93; B.subtilis F-1; F-2; F-3; B.subtilis –К.М.; B.subtillis-99; B.subtilis-2006; B.subtilis-2009, хранящиеся в коллекции отдела токсикологии, а Actinomyces fradiae-96; 99; 2006, Candida krusei -96; 99; 2006, выделенные из почвы покрытой свежим куриным пометом и сенного настоя.

Были созданы консорциумы, обладающие способностью ускорять биодеградацию навоза, помета и других органических отходов.

Ускоритель ферментации представляет собой взвесь микроорганизмов в питательной среде (физиологический раствор, патока). В состав препарата входят микроорганизмы: лучистый гриб рода Actinomyces, Candida и спорообразующие бактерии рода Bacillus, Actinomyces fradiae и Candida krusei, Bacillus subtilis. Указанные культуры микроорганизмов были выделены сотрудниками ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (Тремасов М.Я., Сергейчев А.И., 1996; 1999; Тремасов М.Я., Матросова Л.Е., 2006; 2009) из почвы, покрытой свежим птичьем пометом, и показали высокую ферментирующую активность в отношении органических отходов.

Проведено изучение культурально-морфологических и биохимических свойств, выделенных микроорганизмов, которые были идентифицированы как штаммы Actinomyces fradiae, разновидность – 96, B. subtilis, разновидность – 99, Candida krusei разновидность – 96; 2006; 2009. После изучения свойств культур, паспортизации и депонирования они получили статус штаммов.

Штамм микроорганизма Actinomyces fradiae-96, представитель семейства Actinomycetaceae, рода Actinomyces.

Штамм микроорганизма Bacillus subtilis-99, представитель семейства и рода Bacillus.

Штамм микроорганизма Candida krusei -96, представитель рода Candida.

Actinomyces fradiae-96, Bacillus subtilis-99 и Candida krusei-96 поддерживаются в секторе по производству ветпрепаратов отдела токсикологии ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г.Казань).

Изучение биологических свойств Actinomyces fradiae, Bacillus subtilis- и Candida krusei включало определение морфологических, физиологических и патогенных свойств.

В мазках из агаровых или бульонных культур Actinomyces fradiae представляет собой грамположительные микромицеты, длиной 6,0±0,4 мкм и шириной 4,0±0,5 мкм, располагающимися поодиночке, парами, короткими и длинными цепочками.


загрузка...