Бактерии-деструкторы ароматических углеводородов и их хлорпроизводных: разнообразие, особенности метаболизма, функциональная геномика (29.03.2010)

Автор: Плотникова Елена Генриховна

На основе выделенных и детально охарактеризованных штаммов-деструкторов ПХБ и ХБК предложены и экспериментально обоснованы новые подходы к созданию бактериальных ассоциаций, способных эффективно осуществлять утилизацию различных конгенеров ПХБ (как индивидуальных, так и в составе коммерческих смесей).

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные о способности аэробных бактерий разлагать ароматические соединения при повышенной солености среды расширяют представления о системах биодеградации ПАУ и могут быть использованы для создания новых эффективных биотехнологий восстановления окружающей среды. Выделенные и детально охарактеризованные уникальные штаммы-деструкторы ПХБ, в частности, Rhodococcus ruber Р25 (=ИЭГМ 896) (Патент РФ №2262531), могут применяться для восстановления почв и водоемов, загрязненных ПХБ, а также в технологиях детоксикации промышленных смесей, содержащих хлорбифенилы. Полученные путем селекции галотолерантные нафталинметаболизирующие консорциумы являются перспективными для биоремедиации загрязненных ПАУ почв и водоемов в условиях засоления. Данные по механизмам функционирования консорциумов могут быть использованы для усовершенствования методов биоремедиации засоленных экосистем. Результаты изучения D-плазмид галотолерантных бактерий-деструкторов найдут применение при конструировании рекомбинантных штаммов для создания биотехнологий ремедиации антропогенных экосистем.

Конструирование рекомбинантного пути полной деградации 4ХБК в клетках P. putida определило новые подходы к созданию штаммов микроорганизмов, способных к эффективной деструкции и/или детоксикации различных ксенобиотиков-поллютантов. Полученные рекомбинантные штаммы и плазмиды, содержащие fcb- и ohb-гены, были использованы в совместных исследованиях в Центре микробной экологии Мичиганского университета (г. Лансинг, США). На основе fcb- и ohb-генов был создан ряд генноинженерных штаммов, осуществляющих полную утилизацию орто- и пара-хлорбифенилов. Полученные рекомбинантные штаммы-деструкторы хлорированных бензойных кислот и бифенилов могут быть использованы при создании инновационных технологий защиты окружающей среды от токсичных галогенароматических соединений.

Новые данные о разнообразии бактерий и генетическом потенциале микробного сообщества района солеразработок (г. Березники, Пермский край) являются основой для разработки критериев мониторинга этого уникального микробиоценоза. Результатом изучения таксономического разнообразия явились усовершенствованные системы классификации и идентификации бактерий ряда групп - важными для микробиологической практики и в связи с вопросами интеллектуальной собственности.

). Сведения о последовательностях генов 16S рРНК и функциональных генов (fcb, ohb, har, bph) штаммов-деструкторов включены в GenBank (Национальный центр биологической информации, США; http:/www.ncbi.nlm.nih.gov) и сопряженные базы данных (EMBL, DDBJ, EzTaxon) других стран.

Материалы диссертации используются в лекционных курсах Биологического факультета (на Кафедрах микробиологии и иммунологии; ботаники и генетики растений) Пермского государственного университета.

Основные положения, выносимые на защиту

Бактерии родов Arthrobacter, Rhodococcus, Bacillus, Paenibacillus и Pseudomonas преобладают среди культивируемых аэробных галотолерантных бактерий-деструкторов ПАУ из микробиоценозов района разработок Верхнекамского месторождения солей (г. Березники, Пермский край). Бактерии содержат разнообразные генетические детерминанты (D-плазмиды, гены/опероны), контролирующие ключевые этапы разложения нафталина и фенантрена.

Полное разложение ряда моно- и дихлорбифенилов (феномен ранее не известный для грамположительных бактерий) осуществляют штаммы Microbacterium sp. В51 [(орто-моно(ди)ХБ] и Rhodococcus ruber Р25 [(орто)пара-моноХБ и 2,4’диХБ]. Другие активные штаммы бактерий характеризуются разной окислительной способностью по отношению к орто- и пара-хлорированным бифенилам. Бактерии-деструкторы моно(ди)хлорбифенилов, относящиеся к родам Arthrobacter, Rhodococcus, Janibacter и Pseudomonas, содержат структурно различающиеся гены, контролирующие начальный этап разложения бифенила/ПХБ.

Впервые клонированы и изучены fcb-гены A. globiformis KЗТ1, контролирующие реакцию гидролитического дегалогенирования 4ХБК. В клетках P. putida с использованием fcb-генов сконструирован рекомбинантный путь полной деградации 4ХБК и получены супердеструкторы, характеризующиеся высокой стабильностью признака утилизации этого соединения. Клонированы и охарактеризованы новые ohb-гены P. aeruginosa 142, контролирующие окислительное орто-дегалогенирование 2-/2,4-хлорбензоатов.

В условиях повышенной солености среды (до 8-9% NaCl) эффективная деструкция и утилизация в качестве источника углерода нафталина может осуществляться консорциумами бактерий, включающими галотолерантные бактерии-деструкторы ПАУ порядка Actinоmycetales, а также галотолерантные и умеренно галофильные бактерии, не способные к разложению нафталина. В галотолерантных нафталинметаболизирующих ассоциациях микроорганизмов присутствуют протокооперативные взаимоотношения.

В составе микробиоценозов района разработок Верхнекамского месторождения солей присутствуют галофильные и галотолерантные бактерии новых таксонов.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 110 печатных работ, включая 24 экспериментальные статьи в реферируемых зарубежных, центральных и региональных журналах, 1 обзор, 1 патент, 1 учебное пособие (в соавторстве), 12 статей в сборниках научных статей, 70 тезисов докладов и сообщений на российских и международных конференциях и симпозиумах.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 310 страницах машинописного текста, содержит 30 таблиц и 50 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, пяти глав экспериментальных исследований, отражающих результаты исследований, а также заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 560 литературных источников, из них 60 на русском и 500 на английском языках. В Приложении приведены нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК и функциональных генов (fcb, ohb, har, bph) исследуемых штаммов, депонированных в международной базе данных GenBank.

Связь работы с крупными научными программами. Работа выполнена в соответствии с планом НИР ИЭГМ УрО РАН, тема «Биохимические и генетические системы трансформации сложных органических соединений у бактерий, перспективных для биотехнологии» (№ гос. рег. 0120.0406511), а также в рамках Программ фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и «Фундаментальные основы воспроизводства и оптимизации генофондов растений, животных и человека»; Программы интеграционных фундаментальных исследований Президиума УрО РАН, выполняемых в содружестве с учеными СО РАН; проектов РФФИ №00-04-49056-а, №02-04-49043-а, РФФИ-Урал №02-04-96404_а, №04-04-96042_а, №07-04-96078_а, №07-04-97625-р_офи.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были представлены и обсуждены на международных симпозиумах и конференциях: III Международном симпозиуме «Pseudomonas» (Триест, 1991), Конференции Американского общества микробиологов «Анаэробное дегалогенирование» (Атенс, 1992), Съездах Американского общества микробиологов (1993; 1994; 1996), X Международном конгрессе по бактериологии и прикладной микробиологии (Париж, 2002), I Конгрессе Европейского микробиологического общества (Любляна, 2003), Международных конференциях «Загрязнение окружающей среды» (Москва, 1998; Волгоград-Пермь, 2001; Пермь, 2008), IV и V Международных семинарах-презентациях инновационных научно-технических проектов «Биотехнология-2000» и «Биотехнология-2001» (Пущино, 2000; 2001), Международном семинаре «Научно-технический потенциал Западного Урала в области конверсии военно-промышленного комплекса» (Пермь, 2001), Международном Байкальском симпозиуме «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ» (Иркутск, 2003), Международной конференции «Биохимические взаимодействия микроорганизмов и растений с техногенными загрязнителями окружающей среды» (Саратов, 2003), II и III Международных конференциях «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биологический потенциал» (Пермь, 2005; 2008), Международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 2005), IV и V Международных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005, 2007), Международной научной конференции «Микроорганизмы и биосфера» (Москва, 2007), Международных научных конференциях «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2004, 2008), V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009), Международной научной конференции «Актуальные проблемы микробиологии и биотехнологии» (Кишинев, 2009) и других.

Благодарность. Автор выражает искреннюю благодарность и признательность научному консультанту, заведующему лабораторией химического мутагенеза ИЭГМ УрО РАН, чл.-корр. РАН В.А. Демакову - за многолетнюю помощь и поддержку при выполнении работы; научному консультанту, заведующей отделом ВКМ Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, д.б.н. Л.Н. Евтушенко - за консультативную помощь при выполнении таксономических исследований. Автор признателен коллегам лаборатории, участвовавшим в проведении исследований, чей вклад отражен в совместных публикациях - к.б.н. О.В. Ястребовой, к.б.н. Д.О. Егоровой, к.б.н. Л.Н. Ананьиной, к.б.н. Е.С. Шумковой, к.б.н. А.В. Назарову, а также другим сотрудникам ИЭГМ УрО РАН, способствовавшим успешному выполнению работы. Особую благодарность автор выражает Т.В. Цой и О.В. Мальцевой; сотрудникам ИБФМ РАН к.б.н. И.А. Кошелевой, д.б.н. Л.А. Головлевой, д.б.н. И.П. Соляниковой и другим сотрудникам института за искреннюю поддержку и всестороннюю помощь в проведении исследований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

925 (F+ minA minB thr leu thi) (Stoker et al., 1984) и векторные плазмиды pUC19 (Yanish-Perron et al., 1985), BlueScript («Stratagene», США), pSP329 (Schmidhauser, Helinski, 1985), pRK415(Keen et al., 1988). Для сравнительного изучения использовали типовые культуры из фонда Всероссийской коллекции микроорганизмов (ИБФМ РАН, г. Пущино), Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (ИЭГМ УрО РАН, г. Пермь) и из зарубежных коллекций.

Методы. Для выделения и роста бактерий-деструкторов были использованы жидкие и агаризованные минеральная среда К1 (Зайцев, Карасевич, 1981) и минеральная среда Раймонда (Розанова, Назина, 1982). В качестве полноценных сред использовали среду LB (Маниатис и др., 1984), а также модифицированную среду Раймонда при добавлении 5 г/л триптона и 2.5 г/л дрожжевого экстракта в качестве ростовых субстратов. Чистые культуры бактерий хранили в глицерине при -80°С и в лиофильно высушенном состоянии. Для получения биомассы с целью измерения активностей и очистки ферментов проводили культивирование бактерий в среде К1 методом периодического культивирования, используя нафталин, фенантрен, салицилат, 4ХБК в качестве единственного источника углерода и энергии. Определение количества биомассы проводили спектрофотометрически при ?=540 нм. Количество колониеобразующих единиц (КОЕ) определяли методом серийных разведений с последующим высевом и подсчетом колоний бактерий на чашках с полноценной агаризованной средой. Кинетические характеристики растущей периодической культуры определяли согласно рекомендациям (Перт, 1978).

Морфологические и физиолого-биохимические признаки бактерий изучали по стандартным методикам (Методы общей бактериологии, 1983). Состав аминокислот и сахаров в препаратах клеточных стенок (Schleifer, Kandler, 1972) определяли хроматографически (Suzuki et al., 1993). Определение состава жирных кислот целых клеток и хинонов определяли с использованием методов ГЖХ и масс-спектрометрии (Zhilina et al., 1997; Suzuki et al., 1993).

Выделение тотальной ДНК проводили методом, описанным (Current protocols in molecular biology, 1995). Нуклеотидный состав ДНК определяли по температуре ее тепловой денатурации (Owen, Lapage, 1976). Выявление клонов и предварительную группировку штаммов бактерий осуществляли методами ДНК типирования (REP-ПЦР, BOX-ПЦР и ARDRA) как описано ранее (Versalovic et al. 1994; Scortichini et al., 2002). Амплификацию 16S рРНК генов проводили по описанным методам с использованием универсальных бактериальных праймеров (Weisburg et al., 1991). Определение нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК и функциональных генов проводили с применением набора реактивов CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing Kit на автоматическом секвенаторе MegaBASE 1000 в соответствии с рекомендациями производителя («JSC GE Healthcare», США). Для филогенетического анализа использовали последовательности 16S рРНК генов, депонированные в GenBank (http:/www.ncbi.nlm.nih.gov) и EzTaxon (http://www.eztaxon.org). Последовательности 16S рРНК генов выравнивали с помощью программы Clustal W (Thompson et al., 1994). Построение филогенетических древ производили с помощью пакета программ Treecon (Van de Peer, DeWachter, 1994).

F'. Для обнаружения рекомбинантных клонов, содержащих fcb- и ohb-гены, использовали оригинальные подходы с применением методик (Резников и др., 1970; Parke, 1992). Реакцию ник-трансляции, перенос ДНК на нитроцеллюлозные фильтры, гибридизацию ДНК-ДНК осуществляли по (Rigby et al., 1977; Southern, 1975). Получение мини-клеток E.coli  и включение 35S-метионина проводили в соответствии с рекомендациями (Stoker et al.,1984). Электрофорез белков проводили по (Laemmli, 1970), используя 12.5% полиакриламидный гель.

Структуру ассоциации бактерий SMB3 исследовали методом ДГГЭ фрагментов гена 16S рРНК, амплифицированных с применением эубактериальных праймеров 27F и 518R (Tiirola et al., 2002). Электрофорез был выполнен на DcodeTM Universal Mutation System («Bio-Rad Laboratories», США) согласно протоколу (Muyzer et al., 1993)

Для амплификации fcb-генов использовали праймеры, сконструированные на основе гомологичных последовательностей fcb-генов штамма A. globiformis КЗТ1 (Rodrigues et al., 2001). При изучении bph-генов штаммов деструкторов бифенила/ПХБ применяли вырожденные праймеры, подобранные к участкам генов, кодирующих ?-субъединицы известных ферментов подсемейства бифенил/толуол диоксигеназ (Witzig et al., 2006).

Продукты бактериального разложения ПАУ и 4ХБК определяли методами ТСХ и ВЭЖХ. Анализ метаболитов деструкции ПХБ проводили спектрофотометрически при длине волны 390 - 450 нм и методом ВЭЖХ (Maltseva et al., 1999). Динамику дегалогенирования ПХБ и ХБК контролировали по содержанию ионов хлора в культуральной жидкости, освобожденной от клеток (Резников и др., 1970).

Определение активности ферментов проводили спектрофотометрически. Удельные активности нафталин и фенантрен диоксигеназ определяли согласно (Dua, Meera, 1981), салицилат и 1-гидрокси-2-нафтоат гидроксилаз - (Кiyohara, Nagao, 1978), катехол 2,3- и 1,2-диоксигеназ - (Feist, Hegeman, 1969 и Ornston, 1966), гентизат диоксигеназы - (Crawford et al., 1975). Единицу активности определяли как количество фермента, катализирующее превращение 1 мкМ субстрата или образование 1 мкМ продукта в минуту. Относительную активность рассчитывали, принимая за 100% активность с незамещенным субстратом. Концентрацию белка определяли по модифицированному методу Брэдфорда (Schlomann et al., 1990).

Выделение осмопротекторов проводили из галофильных и галотолерантных бактерий, выращенных в минеральной среде Раймонда с разной соленостью и глюкозой в качестве субстрата. Спектры ЯМР регистрировали на импульсном Фурье-спектрометре ЯМР типа WP80SY («Bruker», Германия) (Хмеленина и др., 2000).

Повторность экспериментов, как минимум, трехкратная. При статистической обработке определяли среднюю арифметическую, стандартное отклонение, доверительный интервал, достоверность результата. Для обработки результатов использовали статистический модуль Exсel 5.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Бактерии-деструкторы полициклических ароматических углеводородов

Методом накопительного культивирования из техногеннозагрязненных почв, грунтов и донных отложений было выделено 240 штаммов-деструкторов нафталина и фенантрена, из них детально охарактеризовано 48 штаммов. Данные анализа нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК, морфологических, физиолого-биохимических и хемотаксономических особенностей изолятов позволили установить их принадлежность родам Arthrobacter, Brevibacterium, Dietzia, Kocuria, Rhodococcus, Streptomyces, Janibacter, Bacillus, Paenibacillus и Pseudomonas. Ниже приводятся характеристики 3-х групп бактерий-деструкторов ПАУ: актинобактерий порядка Actinomyсetales (роды Arthrobacter и Rhodococcus); спорообразующих бактерии родов Bacillus и Pаenibacillus; протеобактерий рода Pseudomonas. Ряд этих бактерий входит в состав нафталинметаболизирующих комплексов (см. раздел 4.1.).

Бактерии-деструкторы рода Arthrobacter

Результаты генотипирования 9 штаммов рода Arthrobacter, выделенных из почв района солеразработок, показали, что штаммы B901, B904, B905 составляют одну геномогруппу. Штаммы SF27, DF14, SN17, SMB145 и SMB11 отличаются как от данной группы, так и между собой по BOX-ДНК профилям. Пять штаммов (B905, SMB11, SMB145, SF27 и DF14) были наиболее близки по нуклеотидным последовательностям 16S рРНК генов с типовым штаммом вида A. сrystallopoietes (уровень сходства 99.7%), а SN17 - с типовым штаммом вида A. arilaitensis (уровень сходства 99.8%). На рисунке 1 представлена дендрограмма, отображающая положение исследуемых штаммов в системе рода Arthrobacter.

Большинство исследуемых артробактерий являются галоалкалотолерантными организмами: растут при щелочных значениях рН (до 9.0), а также в присутствии до 110 г/л NaCl на полноценных средах и до 60 г/л соли на минеральной среде с нафталином в качестве единственного источника углерода и энергии. Штаммы SMB145 и В905 растут на нафталине в присутствии до 90 г/л NaCl, а штамм SF27 - на фенантрене при содержании до 60 г/л соли.

Рис. 1. Филогенетическое древо, построенное с использованием метода “neighbor-joining”, отображающее положение исследуемых штаммов в системе рода Arthrobacter. Масштаб соответствует 2 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью “bootstrap”-анализа 1000 альтернативных деревьев (приведены значения выше 50%).

У бактерий выявлены разнообразные пути метаболизма ПАУ. Штаммы B901, B904, B905, SMB11 и SMB145 осуществляют катаболизм нафталина с образованием салицилата и катехола как ключевых интермедиатов. Анализ деструктивных особенностей другой группы штаммов (штаммов SF27, DF14 и SN17) указывает на наличие у них двух путей разложения салицилата - через катехол и гентизат (Yen, Serdar, 1988; Grund et al., 1992). Штаммы SF27 и DF14 эффективно растут на фенантрене и возможных продуктах его метаболизма – 1-гидрокси-2-нафтоате и орто-фталате. Три других штамма B901, B904 и SMB11 способны к слабому росту на фенантрене и не растут на орто-фталате. На основании анализа метаболитов и изучения ферментативных активностей можно предположить, что утилизация фенантрена штаммами SF27 и DF14 идет по орто-фталатному пути, как описано для нескольких деструкторов рода Arthrobacter (Бабошин и др., 2005; Seo et al., 2006), а штаммы SMB11, B901 и B904 осуществляют деструкцию фенантрена с образованием 1-гидрокси-2-нафтоата, 1,2-дигидрокси-нафталина и салицилата при участии ферментов пути утилизации нафталина (Iwabuchi, Harayama, 1998). Штаммы SN17, В905, B901 и B904 обладают широкой субстратной специфичностью и способны к деструкции не только нафталина, фенантрена, но и бифенила, фенола, алифатических углеводородов.

Результаты исследований на наличие экстрахромосомальной ДНК показали, что штамм SN17 содержит плазмиду размером ~85 т.п.н., в штаммах DF14 и SF27 зарегистрированы плазмиды размером ~120 т.п.н., в штаммах B901, B904 и B905 – размером ~100 т.п.н. При обработке клеток штамма SF27 митомицином С были получены элиминанты, которые не росли на нафталине, фенантрене и 1-гидрокси-2-нафтоате, но сохраняли способность к росту на салицилате. Полученные данные позволяют предположить, что ферменты первичной атаки ароматического кольца фенантрена и 1-гидрокси-2-нафтоата, а также ферменты утилизации нафталина до салицилата у штамма SF27, кодируются плазмидными генами. Факт локализации генов, ответственных за разложение ароматических соединений, в плазмидах описан для многих бактерий (Hayatsu et al., 1999; Eaton, 2001; Sandu et al., 2005).

Рис. 2. Электрофореграммы плазмидных ДНК: (А) 1 – рВ905; 2 – NAH7 (83 т.п.н.); 3 – –pB904; 4 – pB901. (Б) 1 – рSF27; 2 – рDF14; 3 – рSN17; 4 – NAH7 (83 т.п.н.).


загрузка...