Регуляция активности свободных мультиферментных комплексов цикла Кальвина у высших растений (28.11.2011)

Автор: Мирзорахимов Акобир Каримович

Таблица 2

Активности мультиферментных комплексов (МФК), выделенных из листьев хлопчатника сорта 108-Ф при рН 8.5 и ионообменной хроматографии при рН 8.3 ступенчатым и линейным градиентом концентраций NaСl. Фаза развития растений – начало бутонизации.

кД Тип

активности Субстрат Удельная активность,

мкмоль продукта/ мин. на 1 мг белка.

Ступенчатый Линейный

520 Рибозофосфатизомеразная Рибозо-5-фосфат 2116 ±23

2281±24 3210±27

3418±30

520 Фосфорибулокиназная Рибулозо-5-фосфат 2267±19

2307±20 3199±17

3375±21

520 РБФ-карбоксилазная РБФ 0.19±0.01

1.44±0.01 0.95±0.01

1.51±0.01

Из представленных в таблице 2 данных видно, что мультиферментные комплексы почти не различались по рибозофосфатизомеразной и фосфорибулокиназной активности. По величинам же РБФ-карбоксилазной активности независимо от градиента концентраций NaCl мультиферментные комплексы с молекулярной массой 520 кД значительно превосходили мультиферментные комплексы с молекулярной массой 480 кД. Выделенные линейным градиентом NaСl мультиферментные комплексы по РБФ-карбоксилазной превосходили аналогичные мультиферментные комплексы, выделенные ступенчатым градиентом концентраций NaCl.

Таким образом, чёткое разделение мультиферментных комплексов и наибольшие величины всех ферментативных активностей были получены при использовании для получения экстракта из листьев буфера со значением рН 8.5 и при ионообменной хроматографии с буфером рН 8.3 линейным градиентом концентраций NaСl. В связи с этим, данный метод выделения свободных мультиферментных комплексов был использован нами в последующих исследованиях.

ГЛАВА 4. ОБРАЗОВАНИЕ РАЗЛИЧНЫХ МУЛЬТИФЕРМЕНТНЫХ КОМПЛЕКСОВ ЦИКЛА КАЛЬВИНА В ОНТОГЕНЕЗЕ ХЛОПЧАТНИКА

4.1. Возрастные изменения активности свободных мультиферментных комплексов.

В работе (Suss et al., 1993) установлено, что свободные мультиферментные комплексы цикла Кальвина элюировались в широком диапазоне концентраций KCl – 0-600мМ. Молекулярная масса мультиферментных комплексов составляла от 200 до 1000 кД.

Ранее из листьев хлопчатника были выделены свободные мультиферментные комплексы с молекулярной массой 520 и 240 кД (Бабаджанова М.П., Бабаджанова М.А., Алиев К.А., 2006). Мультиферментный комплекс с молекулярной массой 240 кД был выделен в денатурирующих условиях, как и комплекс из листьев шпината с молекулярной массой 284 кД (Rault et al., 1993). Денатурирующие условия при выделении мультиферментных комплексов были использованы для диссоциации их на мультиферментные комплексы с меньшими величинами молекулярных масс.

При выделении из листьев хлопчатника в фазах бутонизации и цветения мультиферментного комплекса в обычных щадящих условиях на профиле элюции свободных белков при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ–целлюлозе суммарный белок выходил в виде двух отчётливых пиков, резко различавшихся по содержанию белка. Фракция с наибольшим содержанием белка представляла собой мультиферментный комплекс с молекулярной массой 520 кД. У фракции с меньшим содержанием белков не была определена ни величина молекулярной массы, ни ферментативные активности (Бабаджанова М.П., Бабаджанова М.А., Алиев, 2002, 2006).

На рис. 6 изображён профиль элюции при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ - целлюлозе линейным градиентом концентраций NaCl свободных белков, выделенных из листьев хлопчатника сорта 108-Ф в фазе 5-6 настоящих листьев. Как видно на рисунке 6, белки элюировались в виде одного отчётливого пика. Наибольшее количество белка элюировалось во фракциях 3,4,5 при концентрации NaCl 100,150 и 200 мМ соответственно. В фазе бутонизации (рис. 7) отчётливо видны два пика (фракция 4 и 8), резко различавшихся по содержанию белка. При выделении мультиферментного комплекса из листьев хлопчатника в фазе массового цветения профиль элюции белков был такой же, как и в фазе бутонизации. Белки фракции 4 элюировались при концентрации NaCl 150-160 мМ, а белки фракции 8 – при концентрации NaCl 370-380 мМ. Белки фракции 4 (рис.6,7) и 8 (рис. 7) брали для определения молекулярной массы и активности ферментов.

Белки 1-го пика (рис. 5.6, фракция 4) проявились в виде одной полосы, молекулярная масса которого оказалась равной 520 ± 20 кД. Начиная с фазы бутонизации растений обнаруживался второй мультиферментный комплекс с молекулярной массой 480 ± 15 кД (рис. 7, фракция 8).

В табл. 3 приведены результаты определения активностей этих мультиферментных комплексов.

Таблица 3

Активности мультиферментных комплексов с различными величинами молекулярных масс, выделенных из листьев хлопчатника сорта 108-Ф на различных фазах развития растений.

Мол.м.,

кД Тип активности Субстрат Активность на различных фазах, мкмоль продукта/(мин. мг белка)

5-6 настоящих листьев Бутонизация Цветение

Рибозофосфатизо-меразная (РФИ)

рибозо-5-фосфат

2673 ± 16

3080 ± 18

3376 ± 20

не обнаружен 3041 ± 17

3345 ± 20

Фосфорибулокиназная

рибозо-5-фосфат +

АТФ 3490 ± 21 4185 ± 26


загрузка...