Иммунные расстройства у больных хроническим сальпингоофоритом: взаимосвязь со структурно-функциональными свойствами эритроцитов и процессами перекисного окисления липидов, фармакокоррекция (28.06.2010)

Автор: Конопля Алексей Александрович

Выраженность перекисного окисления липидов оценивали по содержанию в сыворотке крови, в вагинально-цервикальном смыве и перитонеальной жидкости малонового диальдегида и ацилгидроперекисей (Бенисевич В.И., Идельсон Л.И., 1973; Гаврилов В.Б., Мишкорудная М.И., 1983). Кроме этого, определяли активность каталазы (Королюк М.А. и др., 1988), супероксиддисмутазы (Макаренко Е.В., 1988), концентрацию лактоферрина (тест-системы ЗАО «Вектор-Бест»), стабильных метаболитов оксида азота (Голиков П.П., 2004) и общую антиокислительную активности сыворотки крови (Клебанов Г.И. и др., 1988).

Исследование структурно-функциональных свойств эритроцитов. Эритроциты получали из 5 мл гепаринизированной крови по методу E. Beutler (1985) с незначительной модификацией. Цельную кровь отстаивали дважды в 10 мМ Na-фосфатном буфере (рН=7,4), содержащей 0,9% хлорида натрия и 3% декстрана Т-500, в течение 30 минут при температуре 37 ?С. После этого кровь центрифугировали, удаляли надосадочную жидкость аспирацией. Эритроцитарную массу подвергали дополнительной очистке на хроматографической колонке через НВS-целлюлозу.

В целях определения общей сорбционной способности эритроцитов, обусловленной наружной архитектоникой клеточной мембраны, по отношению к витальным красителям, 1 мл суспензии эритроцитов смешивали в пробирке с 3 мл 0,025% раствора метиленового синего, инкубировали 10 мин при комнатной температуре и центрифугировали в течение 10 мин при 3000 об/мин. При длине волны 630 нм определяли оптическую плотность исходного раствора и надосадочной жидкости в единицах экстинкции по отношению к изотоническому раствору натрия хлорида (Тогайбаев А.А. и др., 1988). Количество поглощенного красителя выражали в процентах по формуле (1):

ССЭ = 100 – 100 С2 / С1 , где (1)

ССЭ – сорбционная способность эритроцитов в % поглощенного красителя;

С1 – оптическая плотность раствора до инкубации с эритроцитами в ед. экстинкции;

С2 – оптическая плотность раствора после инкубации с эритроцитами, ед. экстинкции.

Исследовали также сорбционную емкость гликокаликса эритроцитов, обусловленной олиго- или полисахаридными цепями гликопротеидов, для альцианового синего, который является катионным красителем фталоцианиновой группы и обладает способностью связываться с гликолипидами, гликопротеидами и кислыми мукополисахаридами. В низкой концентрации альциановый синий не повреждает клетки, не проникает в цитоплазму, но сорбируется в количестве, пропорциональном содержанию белков и углеводов в гликокаликсе, отражая степень его вязкости (Семко Г.А., 1998).

Для определения сорбционной емкости гликокаликса 1 мл суспензии эритроцитов, содержащий 4х107 клеток, смешивали с равным объемом изотонического раствора натрия хлорида, содержащего 0,005% альцианового синего, инкубировали 10 мин при температуре 21 ?С и центрифугировали в течение 10 мин при 1000 об/чин. При длине волны 617 нм, используя в качестве контроля изотонический раствор натрия хлорида, измеряли концентрацию красителя в надосадочной жидкости. Количество поглощенного альцианового синего рассчитывали в граммах на 1 эритроцит.

О функциональном состоянии эритроцитов судили также по накоплению малонового диальдегида, который определяли в мембранах эритроцитов соответственно уровню связывания его с тиобарбитуровой кислотой (Банкова В.В. и др., 1987).

Мембраны эритроцитов получали методом G.T. Dodge (1963), разрушая эритроциты осмотическим и механическим гемолизом в 10 мМ Na-фосфатном буфере, после чего проводили отмывку теней от гемоглобина в 10 мМ и 5 мМ Na-фосфатном буфере. Электрофорез проводили в присутствии додецилсульфата натрия в вертикальных пластинах полиакриламидного геля по методу U.K. Laemmli (1970). Белки окрашивали кумаси голубым R-250 по модифицированной методике G. Fairbanks (1971). Денситометрирование одномерных электрофореграмм проводили на лазерном денситометре «Ultroscan XL». Количественное содержание белковых фракций рассчитывали через площадь и известную концентрацию яичного альбумина, выступающего как маркерный белок. Полученные значения пересчитывали на 1 мг общего белка в исследуемом образце сухих мембран эритроцитов.

Статистическая обработка полученных результатов. Статистическую обработку результатов исследования проводили, используя непараметрические методы: критерии Вилкоксона-Манна и Уитни, Крускала-Уоллиса, Фридмана и непараметрический вариант критерия Ньюмена-Кейлса, факторный анализ, кластерный анализ, критерий ?2, а также коэффициент ранговой корреляции Спирмена (Гублер Е.Г., Генкин А.Р., 1973; Лакин Г.Ф., 1980). Статистически значимыми считали различия с p<0,05.

______________________

Примечание: определение иммунологических и биохимических показателей проведено в лаборатории иммуноферментного анализа НИИ Экологии медицины Курского государственного медицинского университета и клинической лаборатории МУЗ ГКБ №4 г. Курска, за что выражаем сотрудникам соответствующих подразделений глубокую признательность.

Степень иммунных расстройств для иммунологических показателей рассчитывали по формуле (1) (Земсков А.М., Передерий В.Г., Земсков В.М., 1994):

Показатель конкретного больного

– 1 ( 100%. (2)

Показатель, принятый за норму

По всем показателям рассчитывали коэффициент диагностической ценности по формуле (2) (Земсков В.М., Земсков А.М., 1996):

2 ((12 + (22)

Kj = , (3)

(M1 - M2)2

где (1, (2 – средние квадратичные отклонения, M1 и M2 - средние арифметические величины показателей.

А.В. с соавт., 2003). Степень изменения иммунологических показателей под влиянием фармакологических средств и физиотерапевтических факторов определялась по формуле (3) (Земсков А.М., Земсков В.М., Полякова С.Д., 1997):

% больных со 2-3 степенью расстройств показателей

после лечения разработанными методами

1 – ( 100%. (4)

% больных со 2-3 степенью расстройств показателей

после базисного лечения

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Иммунные и оксидантные нарушения у больных хроническим сальпингоофоритом. У пациенток, поступивших в стационар для оперативного лечения по поводу бесплодия, имевших в анамнезе ХСО в стадии ремиссии установлена супрессия клеточного звена иммунитета, о чем свидетельствовало снижение в крови количества Т-хелперов (CD4), естественных киллеров (CD16), клеток маркеров ранней (CD25) и поздней активации (HLA-DR), при усилении индукторного фактора апоптоза – запрограммированной гибели клеток (CD95), выявлен дисбаланс гуморального звена, т.к. снижено количество В-лимфоцитов и уровень IgM при повышении концентрации Ig классов А и G (рис. 1).

В плазме крови умеренно, но достоверно, увеличена концентрация 6 из 8 исследованных провоспалительных цитокинов (ФНО?, ИЛ-1?, ИЛ-2, ИЛ-6, Г-КСФ и ИЛ-8). Кроме этого, установлена активация системы комплемента по альтернативному пути (повышение в плазме крови С3 и С3а-компонентов) с одновременным компенсаторным повышением регуляторного ингибитора (фактора Н). Не смотря на повышенный уровень провоспалительных цитокинов, в пределах нормы остались противовоспалительные цитокины (ИЛ-4, ИЛ-10) и рецепторный антагонист ИЛ-1 (РАИЛ) (рис. 2).

Рис. 1. Иммунофенотипированные лимфоциты и концентрация иммуноглобулинов и ЦИК в плазме крови у больных ХСО в стадии ремиссии и обострения (без осложнений).

Примечания (здесь и на рис. 2): 1. Радиус окружности – показатели у здоровых доноров (группа 1); 2. Сплошная заливка - показатели у больных ХСО в стадии ремиссии (группа 2); 3. - показатели у больных ХСО в стадии обострения (без осложнений) (группа 3); 4. - p<0,05 между показателями 1 и 2 групп; 5. – p<0,05 между показателями 2 и 3 групп; 6. Между всеми показателями 1 и 3 групп различия достоверны (за исключением CD3).

Рис. 2. Концентрация цитокинов и компонентов системы комплемента в плазме крови у больных ХСО в стадии ремиссии и обострения (без осложнений).

Примечания: см. рис. 1.

У больных ХСО в стадии ремиссии в крови снижены ФИ, ФЧ и НСТ-ст. нейтрофилов, что привело к снижению ИАФ, ФРН, увеличена концентрация лактоферрина, продуктов ПОЛ (МДА, АГП), стабильных метаболитов NO и снижена активность СОД (табл. 4).

Таблица 4

ФМА нейтрофилов периферической крови, концентрация продуктов ПОЛ и стабильных метаболитов NO, активность каталазы, СОД и ОАА в плазме крови у больных ХСО (М±m)

Показатели Едини-цы изме-рения Здоровые доноры Больные ХСО


загрузка...