ПЕКТИНОВЫЕ ВЕЩЕСТВА КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР РАСТЕНИЙ (27.09.2012)

Автор: ГЮНТЕР Елена Александровна

внеклеточного арабиногалактана из каллуса смолевки (в) и ряски (е).

* Различия достоверны при р < 0.05, контроль – отсутствие фермента.

Наблюдаемый эффект может быть связан с большим количеством остатков галактозы, которые могут занимать терминальное положение в составе боковых цепей лемнана. Кроме того, получены образцы силенана и лемнана со сниженным содержанием арабинозы на 68-73% и 74% соответственно Отщепление остатков галактозы и арабинозы от боковых цепей RG-I, скорее всего, вызвано увеличением активности внутриклеточной и внеклеточной ?-галактозидазы и ?-L-арабинофуранозидазы при добавлении в среду галактозидазы. Более существенное снижение содержания остатков галактуроновой кислоты в силенане (на 19-29%), чем в лемнане (на 11%) является следствием значительного увеличения активности внутриклеточной и внеклеточной полигалактуроназы. В то же время активность полигалактуроназы каллуса ряски отсутствует или является очень низкой.

В присутствии ?-галактозидазы в низких концентрациях (10-3-10-1 мг/мл) получены образцы лемнана с увеличенным на 9-46% содержанием остатков галактуроновой кислоты и сниженным на 46% количеством остатков галактозы (рис. 2). При этом основные изменения моносахаридного состава пектина происходят в наиболее разветвленном фрагменте лемнана с Mw 100-300 кДа. Увеличение количества галактуроновой кислоты свидетельствует об увеличении содержания галактуронана в составе макромолекулы лемнана и связано с низкой активностью пектиназы и пектинэстеразы и повышенной активностью ?-галактозидазы.

Снижение содержания остатков галактозы в AG (на 56-71%) и AG1 (на 39%) из каллуса смолевки при высоких концентрациях галактозидазы, по всей видимости, связано с большим количеством остатков галактозы (в том числе терминальных) в боковых цепях AG смолевки, чем AG ряски, а также с высокой активностью ?-галактозидазы. Соотношение арабиноза/галактоза составляет 1:(21.2-34.4) и 1:11.2 в AG смолевки и ряски соответственно. Более существенное снижение содержания остатков арабинозы в AG смолевки (на 89-91%), чем в AG ряски (на 75%) при высоких концентрациях галактозидазы (1-5 мг/мл), вероятно, связаны с более высокой активностью ?-L-арабинофуранозидазы.

В присутствии 1-5 мг/мл ?-галактозидазы снижается содержание остатков арабинозы в AG1 смолевки на 87-95%, а в AG1 ряски на 92% (рис. 2). Кроме того, в отличие от AG1 смолевки количество остатков арабинозы в AG1 ряски уменьшается при низких концентрациях галактозидазы (10-3-10-1 мг/мл), что связано с увеличением активности ?-L-арабинофуранозидазы в клетках. Смещение Mw-распределения AG1 ряски в сторону большей Mw (>300 кДа) связано с разрушением более разветвленных фрагментов с меньшей Mw (50-300 кДа) при 10-3-1 мг/мл фермента.

Таким образом, степень модификации полисахаридов под действием гликаназ определяется особенностями их структуры, в частности, строением боковых цепей и степенью метилэтерификации. Добавление высоких концентраций пектиназы и ?-галактозидазы в культуральную среду вызывает снижение молекулярной массы силенана и лемнана и содержания 1,4-?-D-галактуронана, снижение содержания остатков арабинозы и галактозы в боковых углеводных цепях разветвленной области RG-I и в макромолекуле арабиногалактана, образование и разрушение галактана. Присутствие в среде низких концентраций ?-галактозидазы и пектиназы вызывает увеличение молекулярной массы и содержания 1,4-?-D-галактуронана в макромолекуле лемнана и снижение содержания остатков арабинозы в арабиногалактане.

Рис. 2. Действие ?-галактозидазы на моносахаридный состав силенана (а), лемнана (г), внутриклеточного арабиногалактана из каллуса смолевки (б) и ряски (д), внеклеточного арабиногалактана из каллуса смолевки (в) и ряски (е). * Различия достоверны при р < 0.05, контроль – отсутствие фермента.

4. Модификация пектинов и арабиногалактанов клеточных

культур под действием трофических и гормональных факторов

При исследовании молекулярно-массового распределения силенана и AG обнаружена положительная корреляция (R = 0.99 и R = 0.85, p<0.05) между концентрацией сахарозы в среде и выходом фрагментов силенана и AG с Mw>300 кДа соответственно. Полученные данные свидетельствуют об увеличении выхода указанного фрагмента в силенане и AG с ростом концентрации сахарозы в среде от 10 до 40 г/л и от 10 до 100 г/л соответственно. Для фрагментов с Mw 100-300 кДа и 50-100 кДа характерна отрицательная корреляция, что говорит о снижении процентного содержания фрагментов с меньшей Mw в силенане и AG. Показано, что с увеличением концентрации сахарозы в среде возрастает содержание остатков арабинозы и галактозы во фрагментах силенана и AG с Mw >300 кДа. Для фракции AG с Mw 100-300 кДа характерна тенденция к снижению содержания этих моносахаридных остатков. При увеличении концентрации сахарозы в среде от 10 до 40 г/л для фрагмента силенана с Mw 100-300 кДа наблюдается тенденция к увеличению содержания остатков арабинозы и галактозы, и к снижению числа остатков галактуроновой кислоты.

Увеличение выхода фрагментов силенана и AG с Mw>300 кДа и содержания в их составе остатков арабинозы и галактозы может быть связано с увеличением концентрации сахарозы в среде, являющейся донором UDP-глюкозы – ключевого моносахарида, из которого образуются другие моносахариды, участвующие в биосинтезе полисахаридов. Таким образом, при увеличении концентрации сахарозы синтезируется пектин и AG с большим количеством боковых цепей, состоящих из остатков арабинозы и галактозы, и с большей Mw.

Выход фракции силенана с Mw > 300 кДа увеличивается на среде, содержащей глюкозу, смесь сахарозы и арабинозы, повышенные концентрации кальция (4.5 мМ) и азота (90 мМ) (рис. 3а). Выход фракции AG с Mw > 300 кДа увеличивается на среде с добавлением смеси сахарозы и арабинозы, сахарозы и глюкозы, галактозы, 2,4-Д. Содержание остатков арабинозы в силенане и AG с Mw > 300 кДа увеличивается в присутствии 2,4-Д или смеси сахарозы и арабинозы, что указывает на биосинтез пектина с более высоким содержанием нейтральных боковых цепей и увеличение арабинозных групп на коре галактана (рис. 3б,в). Снижение содержания остатков арабинозы и галактозы при увеличении концентрации кальция и азота в среде указывает на отщепление боковых цепей силенана или уменьшение их длины (рис. 3б).

На среде, содержащей галактозу, увеличивается содержание остатков галактозы и арабинозы в AG с Mw > 300 кДа. При недостатке в среде азота или фосфата снижающееся содержание остатков арабинозы и/или галактозы во фракции AG с Mw >300 кДа указывает на деградацию полисахарида (рис. 3в).

Таким образом, количество полисахаридных цепей пектина и арабиногалактана с молекулярной массой более 300 кДа и содержание остатков арабинозы и галактозы в их боковых углеводных цепях увеличивается при добавлении в культуральную среду арабинозы, галактозы, сахарозы и 2,4-Д.

Рис. 3. Влияние компонентов питательной среды на выход (а) и моносахаридный состав фракций силенана SVC (б) и арабиногалактана AG (в), полученных после фракционирования на ультрафильтрационных мембранах. Контроль: 2,4-Д, 1.0 мг/л; сахароза, 30 г/л; азот, 60 мМ; кальций, 3.0 мМ.

5. Действие УФ-облучения на физиолого-биохимические

характеристики каллусной культуры S. vulgaris

УФ-В (( = 280-315 нм). Облучение культур клеток смолевки различными дозами УФ-В в диапазоне от 0.63 до 2.18 Вт/м2 в течение 1 ч и от 0.2 до 13.0 Вт/м2 в течение 3 ч показало, что продолжительность экспозиции существенно не влияет на ростовые характеристики клеток, выход и продуктивность силенана и AG, тогда как варьирование интенсивности облучения вызывает изменения в содержании полисахаридов. Наибольшие выходы пектина (11-12%) и продуктивность на литр среды (0.8-0.9 г/л) отмечены при мощности облучения 0.63 и 1.4 Вт/м2 (экспозиция 1 и 3 ч). Увеличение выхода AG наблюдается при 0.83 Вт/м2 при 1 ч экспозиции, а также при 0.2-0.5, 2.18 и 13 Вт/м2 при 3 ч экспозиции. Содержание AG на 1 л среды возрастает при 0.2, 0.3 и 2.18 Вт/м2 после 3 ч экспозиции. Методами кислотного гидролиза и ионообменной хроматографии установлено, что облучение вызывает снижение содержания остатков арабинозы и галактозы в силенане, особенно при высоких дозах облучения и экспозиции 3 ч – 0.63-13.0 Вт/м2 и 1.4-13.0 Вт/м2 соответственно. При некоторых дозах облучения (0.63, 0.83, 3.4 и 7.7 Вт/м2) отмечено существенное снижение количества остатков арабинозы в AG. Полученные данные свидетельствуют о том, что под воздействием УФ-В может происходить нарушение биосинтеза боковых цепей пектина и AG, а также постсинтетическая модификация полисахаридов, включающая отщепление остатков арабинозы и галактозы от их боковых цепей.

УФ-С ((=254 нм). Изменение продолжительности облучения УФ-С (10-60 мин) не влияет на содержание полисахаридов в каллусе смолевки, но оказывает действие на моносахаридный состав полисахаридов и активность гликаназ клеток. Содержание остатков арабинозы и галактозы в силенане и остатков арабинозы в AG из каллуса, облученного УФ-С (доза 70 Вт/м2) в середине экспоненциальной фазы роста (12 сут) снижается на стационарной фазе роста клеток (21 сут) независимо от продолжительности экспозиции (рис. 4). Изменения в моносахаридном составе полисахаридов сохраняются в течение длительного культивирования клеток. Уменьшение содержания остатков арабинозы и галактозы в полисахаридах вследствие облучения связано с увеличением активности ?-L-арабинофуранозидазы и ?-галактозидазы соответственно. В облученных клетках степень этерификации силенана снижается в три раза, что сопровождается увеличением активности пектинэстеразы.

Рис. 4. Влияние УФ-С на содержание галактозы (Gal) и арабинозы (Ara) в силенане (SVC) и арабиногалактане (AG). * Различия достоверны при р < 0.05, контроль – необлученные клетки.

Таким образом, под воздействием УФ-облучения происходит активация ?-L-арабинофуранозидазы, ?-галактозидазы и пектинэстеразы, метилдеэтерификация пектина и разрушение боковых цепей пектина и AG клеточных стенок.

6. Действие фитопатогенных грибов и элиситоров на полисахаридный состав и активность гликаназ каллусной культуры S. vulgaris

Фитопатогенные грибы. Исследована модификация пектина и AG каллуса смолевки обыкновенной в результате сокультивирования с фитопатогенными грибами P. dierckxii, A. niger, T. harzianum и Fusarium sp. и индукция ферментов, разрушающих клеточную стенку (рис. 5). Увеличение выхода пектина в совместной культуре с P. dierckxii, T. harzianum и Fusarium sp. может свидетельствовать о секреции растительной клеткой нового материала клеточной стенки в область ее деградации. Содержание AG в каллусе существенно не изменяется. Продуцирование внеклеточного AG1 на литр среды снижается при сокультивировании каллуса с P. dierckxii, T. harzianum и A. niger, что указывает на его деградацию в результате патогенеза.

Снижение выхода фракции силенана с Mw >300 кДа и сдвиг Mw-распределения в сторону увеличения выхода фракций с меньшей Mw (100-300 и 50-100 кДа) указывает на деполимеризацию пектинов клеточной стенки при сокультивировани каллуса с P. dierckxii, Fusarium sp. и A. niger. Снижение содержания остатков галактуроновой кислоты в пектине в 1.2-1.4 раза (рис. 6а) при сокультивировании каллуса с T. harzianum, Fusarium sp. и A. niger может быть вызвано увеличением активности полигалактуроназы как гриба, так и каллуса (рис. 6б). Для P. dierckxii и Fusarium sp. характерна высокая активность внутриклеточной и внеклеточной полигалактуроназы, а для T. harzianum – внеклеточной полигалактуроназы как до, так и после сокультивирования с каллусом. В результате сокультивирования в мицелии A. niger происходит увеличение активности внутриклеточной и внеклеточной полигалактуроназы. Данные свидетельствуют о снижении содержания 1,4-?-D-галактуронана в пектиновой макромолекуле.

Рис. 5. Сокультивирование каллуса

Рис. 6. Влияние сокультивирования каллуса смолевки с фитопатогенными грибами на содержание остатков D-галактуроновой кислоты в силенане (а) и на активность полигалактуроназы в каллусе, среде и мицелии (б). * Различия достоверны при р < 0.05, контроль – неинфицированный каллус.

Сокультивирование каллуса смолевки с P. dierckxii, T. harzianum и A. niger вызывает увеличение активности 1,3-?-глюканазы в каллусе. Полученные данные свидетельствуют о проявлении клетками защитного механизма, включающего в себя синтез защитных PR-белков – 1,3-?-глюканаз, которые способны гидролизовать компоненты клеточных стенок фитопатогенов. Различия в активности ферментов патогенных грибов, проявляемые при сокультивировании с растительными клетками, являются результатом различных взаимоотношений хозяин-патоген, которые определяются специфичностью патогена (Miedes and Lorences, 2006).

Таким образом, сокультивирование каллусных клеток с фитопатогенными грибами вызывает снижение молекулярной массы пектина и содержания 1,4-?-D-галактуронана в пектиновой макромолекуле. Модификация строения пектинов клеточной стенки обусловлена изменением активности гликаназ как мицелиальных так и растительных клеток.

Действие элиситора из Aspergillus niger. В качестве элиситора использовали компоненты клеточных стенок микромицета A. niger: галактоманнан и глюкан. Показано, что в присутствии элиситора (1.9-177 мг/л) процентное содержание силенана в клетках снижается в 1.6-2.7 раза, выход AG существенно не изменяется, а продукция AG и AG1 на литр среды увеличивается в 1.5-2.2 раза по сравнению с контролем.

Снижение в присутствии элиситора Mn, а также Mw силенана при низкой и высокой концентрациях элиситора (табл. 12), вероятно, обусловлено увеличением активности полигалактуроназы в каллусе. Последняя, скорее всего, вызывает снижение содержания остатков галактуроновой кислоты в пектине при низких и средних концентрациях элиситора. Кроме того, увеличивается активность пектинметилэстеразы, которая удаляет метильные группы пектина, в результате чего усиливается гидролиз этого полимера под действием полигалактуроназы. Содержание остатков арабинозы в AG1 увеличивается в 1.4-2.0 раза при концентрациях 11-177 мг/л, что свидетельствует о биосинтезе AG1 с более высоким содержанием остатков арабинозы в боковых цепях. Увеличение активности 1,3-(-глюканазы при средних и высоких концентрациях элиситора свидетельствует о проявлении клетками защитного механизма.

Таблица 12. Влияние элиситоров на молекулярную массу

и содержание галактуроновой кислоты в силенане

Элиситор из A. niger Элиситор из M. silenes

Концентрация элиситора, мг/л Mw, кДа Mn, кДа GalA, % Концентрация элиситора, мг/л Mw, кДа Mn, кДа GalA, %

0 (Контроль) 313 48.9 78.0 0 (Контроль) 313 48.9 75.0

1.9 169 33.2 66.6* 0.3 352 29.0 52.7*

11 н.о. н.о. 66.0* 2.8 188 15.9 47.0*

27 418 29.5 62.7* 8.5 227 18.1 54.9*

105 303 26.7 68.4 21 213 11.6 46.7*


загрузка...