Генетико-физиологические аспекты социального поведения ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense (27.09.2010)

Автор: Шелудько Андрей Вячеславович

Многие бактерии адаптируются к микроаэрофильным условиям, благодаря образованию цитохром c оксидазы cbb3–типа, кодируемой опероном ccoNOQP. Ген ccoN впервые выявлен нами в плазмидной ДНК азоспирилл. Кодируемая p85 каталитическая субъединица I (CcoN) цитохром c оксидазы обладает свойствами, достаточными для работы фермента в качестве протонной помпы. Трансмембранный протонный потенциал, в частности, используется как источник энергии для вращения бактериальных жгутиков (Скулачев, 1989).

В секвенированном сегменте p85 обнаружен ген metC. В случае E. coli metC–мутанты, дефектные по синтезу гомоцистеина, имели более высокий уровень экспрессии гена флавогемоглобина (hmp), индуцируемого NO (Membrillo-Hernandez et al., 1998). Продукт orf164, по–видимому, не связан с процессами денитрификации или регуляции метаболизма в ответ на оксиды азота и редокс–статус клетки.

Локализация охарактеризованного комплекса генов в р85 Sp245 недалеко от IS–элементов ISAzba1 и ISAzba2 (рис. 8) свидетельствует о потенциальной мобильности этих генов, что может сказываться на поведении бактерий. Так у спонтанного мутанта Sp245.5 с крупной плазмидной перестройкой исчезновение p85 и одного из двух фрагментов тотальной ДНК, гомологичных 2.4–т.п.н. EcoRI–фрагменту p85, содержащему, как выяснилось, часть гена nirK, а также orf208 и orf181, сопровождалось утратой способности бактерий к нитритредукции (Кацы, 2002б). Скорость движения клеток Sp245.5 в жидкой среде сильно редуцирована.

Не исключено, что появление спонтанных Swa++–производных (Sp245.P1–Sp245.P5) обусловлено изменениями в структуре ДНК р85, затрагивающими комплекс генов, расположенный недалеко от IS элементов ISAzba1 и ISAzba2. Использован метод ПЦР–амплификации на ДНК названных штаммов целевых районов р85 с парами специфических прямых и обратных праймеров к генам nirK–orf208, hdfR, hdfR–ccoN, ccoN–metC и orf414 (рис. 8). ПЦР с парой праймеров, специфичных к 3'–концу гена hdfR (у Sp245 продукт амплификации имеет длину 411 п.н.), давали негативные результаты на ДНК из суперроящихся штаммов Sp245.P1 и Sp245.P5. Таким образом, спонтанные перестройки, приводящие к появлению Swa++–вариантов, в ряде случаев сопровождаются утратой или существенной модификацией гена hdfR, локализованного в p85.

Известно, что на активность транскрипции генов может влиять общая структура окружающей ДНК, особенно степень ее суперспирализации. Эта структура модулирует, а иногда и определяет силу промоторов (Perez-Martin et al., 1994). Возможно, мы имеем дело именно с таким случаем, а интеграция в p85 вектора pJFF350 является препятствием для осуществления на должном уровне подобной регуляции экспрессии ряда генов p85. В пользу данного предположения говорит тот факт, что у мутанта SK051 вектор pJFF350 интегрировал в тот же сайт p85, что и у мутанта SK248. Различия между двумя коинтегратами p85::pJFF350 заключаются лишь в утрате примерно 1.5 т.п.н. ДНК вектора из коинтеграта, образовавшегося в клетках штамма SK051. Фенотип у мутантов A. brasilense SK051 и SK248 разный.

3.9 Подвижность A. brasilense Sp245 в лабораторных средах разного состава. Возникает вопрос, в каких условиях азоспириллы используют потенциал, предоставляемый тем или иным типом подвижности. Выявление факторов внешней среды, способствующих доминированию одного из способов распространения, интересно с точки зрения изучения механизмов адаптации азоспирилл к обитанию в разнообразных экологических нишах, в том числе, в ассоциациях с растениями.

Проведено сравнение скорости плавания и особенностей социальной подвижности в присутствии солей аммония, нитратов или нитритов у A. brasilense Sp245 и его спонтанных Swa++–вариантов Sp245.P, у двух из которых утрачен ген hdfR. В жидкой среде для нитратредукции (MPSS) с нитратом калия клетки Sp245.P1, Sp245.P3 и Sp245.P5, выросшие в условиях интенсивной аэрации, как и в случае MSM с аммонием (см. табл. 2), плавали значительно быстрее, чем особи Sp245. При замене нитрата на нитрит у Sp245 и Sp245.P3 подвижность подавлялась, а у Sp245.P1 и Sp245.P5 скорость движения практически не снижалась. У бактерий, выращенных в условиях недостатка кислорода в жидкой MPSS, скорость движения клеток Sp245.P1, Sp245.P3 и Sp245.P5 снижается, не зависит от источника азота и близка к показателю, характерному для Sp245 в сходных условиях в присутствии нитрата. Однако у Sp245 при замене нитрата на нитрит при недостатке кислорода клетки плавают медленнее.

Диаметр колоний, формируемых в полужидкой MSM всеми исследованными штаммами, максимален в отсутствие солей азота в среде и снижается при добавлении солей азота (1 г/л) в ряду “NH4Cl > KNO3 > KNO2”. При этом на среде MSM с KNO2 все исследованные варианты Sp245.P утрачивают способность к Swa++–распространению. Однако на полужидкой среде MPSS, отличающейся от MSM более богатым составом (добавлен пептон, 5 г/л) и содержащей сукцинат вместо малата, штамм Sp245.P5 оказывается менее чувствительным к токсическому действию нитрита и сохраняет Swa++–фенотип. Измерение скорости движения клеток на полужидкой MPSS показало, что на среде с нитратом клетки Sp245.P1, Sp245.P3 и Sp245.P5 двигаются быстрее родительского штамма. На среде с нитритом скорость движения клеток падает у Sp245.P1, Sp245.P3 и Sp245, а межштаммовые различия нивелируются. В случае штамма Sp245.P5 замена нитрата на нитрит не влияет на подвижность клеток.

Таким образом, выявлены различия в поведении спонтанных вариантов Sp245.P с изменениями в структуре p85, имеющих одинаковый Swa++–фенотип в присутствии молекулярного азота или хлорида аммония, при замене источников азота в среде на нитрат или нитрит.

Переходы в способах распространения у Sp245 при использовании богатых полужидких сред MPSS или LB выявить не удалось. Возможно, в случае использования среды, насыщенной ростовыми факторами, доля клеток с Gri–распространением мала, поскольку в среде могут находиться факторы, значительно увеличивающие число роящихся бактерий. В результате поток роящихся азоспирилл не позволяет наблюдать особи, формирующие агрегаты. В связи с этим предположением интересны наблюдения за поведением Sp245 на средах, в которых один и тот же субстрат может быть источником углерода и азота, например, аминокислот. В присутствии малата и аммония, или без них диаметры макроколоний не различаются как в случае Sp245, так и BK570, SK048 или SK454. Самые крупные макроколонии выявляются у Sp245, но не у BK570 и SK048, при добавлении в среду аланина или триптофана. Пролин стимулирует роение BK570. В случае SK048 и SK454 ни одна из 18 исследованных аминокислот не способствовала увеличению скорости Gri–подвижности. Снижение скорости распространения происходит в присутствии аспарагина, аспарагиновой кислоты или треонина как в случае Swa–, так и Gri–подвижности (у Sp245, BK570, SK048 и SK454). Гистидин, глутамин, валин, метионин или пролин блокировали подвижность SK048 и SK454. Таким образом, в случае Swa?, Swa++ или Gri+–подвижности набор аминокислот, влияющих на эффективность распространения бактерий, различен. Вероятно, это имеет определенное значение в процессе адаптации азоспирилл к существованию в симбиозе с растениями, поскольку состав корневых экссудатов (преимущественное содержание в составе той или иной аминокислоты) может определять преобладание того или иного фенотипа подвижности.

В случае Sp245 аспарагиновая кислота, серин или треонин способствовали индукции Gri+–подвижности. Интересен тот факт, что аминокислоты, которые влияют на проявление Gri+ фенотипа у Sp245, не стимулируют скорость движения Gri+–мутантов SK048 или SK454. Более того, на среде с аспарагиновой кислотой и треонином колонии SK048 и SK454 мельче. Вероятно, факторы, способствующие переходу клеток к Gri–подвижности, и факторы, активизирующие скорость мигрирующих подобным образом бактерий, различаются.

3.10 Социальная подвижность A. brasilense в присутствии корневых экссудатов пшеницы. Исследовано влияние корневых экссудатов пшеницы (к/э) на характер/эффективность подвижности азоспирилл. Установлено, что диаметр колоний, сформированных Sp245 на полужидкой MSM (0.4% агара) с добавлением к/э 10–дневных проростков пшеницы, значительно превышает контрольный. У роящегося мутанта KM252 с изменениями в синтезе полисахаридов размер колоний в присутствии к/э возрастает, но различия не столь существенны, как у родительского штамма. В то же время, у Swa++–мутантов ВК468, ВК571 и ВК759Р увеличения размера колоний в присутствии к/э не происходит. При этом к/э не оказывают существенного влияния на скорость роста бактериальных культур. Различий в скоростях движения клеток, выросших в жидких средах с к/э, и без них также не наблюдается. Анализ гетерогенности популяции азоспирилл в способах распространения в полужидких средах показал, что присутствие к/э способствует доминированию в популяции Sp245 роящихся клонов. Так, после 48 ч инкубации (MSM + среда для растений) 81% колоний Sp245 имели Swa+–фенотип, 18.3% Swa?– и 0.7% Gri+–фенотип. На MSM + к/э 100% колоний Sp245 были Swa+. В случае мутантов КМ018 и ВК759G добавление к/э способствовало возрастанию частоты перехода к роящимся вариантам.

Вероятно, на полужидких средах в присутствии к/э повышается эффективность коллективного распространения клеток Sp245. При этом к/э не влияют на скорость индивидуального движения клеток за счет активности полярного жгутика, как в случае Sp245, так и в случае Swa++–мутантов ВК468, ВК571, BK759P, роение которых не зависит от присутствия к/э. Интересно, что экссудаты способствуют доминированию Swa+–клонов или уменьшению числа Swa? и Gri+–клонов, встречающихся в популяции Sp245, КМ018 и ВК759G. Вероятно, к/э проростков пшеницы способны оказывать модулирующее действие на механизмы/системы, обеспечивающие скоординированную подвижность A. brasilense Sp245 в полужидких средах. При этом поведение Swa++–производных Sp245, клетки которых двигаются со скоростью, близкой к скорости, наблюдаемой у родительского штамма, не зависит от присутствия корневых экссудатов. Возможно, эффект обусловлен тем, что у мутантов системы, обеспечивающие скоординированную подвижность, максимально антивны и дополнительный сигнал, индуцируемый наличием в среде к/э, в этом случае не является столь значимым.

Можно предположить, что в составе к/э присутствуют компоненты, “имитирующие” действие внутрипопуляционных бактериальных факторов (Teplitski et al., 2000), регулирующих социальное поведение азаспирилл. При этом клетки Swa++–мутантов не воспринимают сигнал либо из-за высокого уровня продукции собственного регулятора или в результате изменения системы “рецепции”. Добавление к/э пшеницы в среду для роста бактерий приводит к изменению соотношения моносахаридов в составе экзополисахаридов и электрофоретического профиля ЛПС A. brasilense Cd (Fischer et al., 2003). Не исключено, что к/э модифицируют какие-либо поверхностные полимеры Sp245, участвующие в формировании контактов между бактериями, перемещающимися в полужидкой среде, а в случае Swa++–мутантов эти изменения не являются существенными. Так, в случае LpsI? Cal?–мутанта KM252 корневые выделения, присутствующие в среде, лишь незначительно стимулируют роение, тогда как клетки родительского штамма перемещаются в два раза быстрее. Таким образом, корневые экссудаты проростков пшеницы стимулируют роение клеток A. brasilense Sp245 по непонятному механизму и способствуют переходу неподвижных или Gri+–клонов к роению.

3.11 Подвижность A. brasilense в присутствии растительных лектинов, обладающих разной специфичностью. Известно, что взаимодействие компонентов поверхности азоспирилл, содержащих остатки N–ацетил–?–D–глюкозамина, с агглютинином зародышей пшеницы (WGA) может опосредовать ранние этапы формирования растительно–бактериальных ассоциаций и индуцировать соответствующие изменения в метаболизме бактерий (Антонюк, 2005). Так как двигательная активность бактерий важна для формирования их симбиозов с растениями (Кацы, 2003), интересно выяснить, оказывают ли фитолектины влияние на этот аспект поведения азоспирилл.

3.11.1 Скорость плавания A. brasilense в присутствии лектинов растений. В присутствии WGA, агглютинина клубней картофеля (STA) или лектина из утесника обыкновенного (UEAII), обладающих сродством к N–ацетил–?–D–глюкозамину или его олигомерам, скорость плавания клеток штамма Sp245 снижалась (рис. 9). Конканавалин А (ConA) или фитогемагглютинин–P (PHA–P), обладающие иной углеводной специфичностью, на подвижность Sp245 не влияли.

Более подробно изучение специфичности ингибирования движения бактерий осуществляли на примере WGA. В результате блокировки активных центров WGA глюкозамином или его олигомером, N,N’,N’’–триацетилхитотриозой (хитотриозой), ингибирующая активность WGA элиминировалась. Рамноза или глюкоза, входящие в состав полисахаридов клеточной поверхности штамма Sp245, но не являющиеся гаптенами для данного лектина (Коннова с соавт., 1992), не влияли на способность WGA снижать подвижность азоспирилл. Напротив, добавление препарата ЛПБК, содержащего остатки глюкозамина, приводило к практически полному восстановлению скорости плавания бактерий, характерной для клеток в отсутствие WGA. Контрольные эксперименты показали, что ни одно из используемых для блокирования веществ само по себе не вызывало снижения скорости плавания бактерий. По-видимому, снижение скорости плавания азоспирилл в присутствии WGA происходило в основном вследствие специфического связывания этого лектина с полимерами поверхности бактерий, содержащими глюкозамин. Скорость плавания клеток штамма A. brasilense Sp107 в присутствии WGA уменьшалась в меньшей степени, чем у Sp245. При этом для обоих штаммов характерен близкий моносахаридный состав полисахаридной части экзополимеров, но у Sp107 выявлен более низкий процент содержания глюкозамина в составе полимеров клеточной поверхности по сравнению с Sp245 (Коннова с соавт., 1992).

3.11.2 Влияние фитолектинов на поведение A. brasilense в полужидких средах. В полужидкой MSM с WGA или STA образовывались колонии Sp245 смешанного мутно–зернистого фенотипа (рис. 10), что может свидетельствовать о переходе части популяции от роения к распространению с образованием микроколоний. BSA или ConA такого эффекта не вызывали (рис. 10). При блокировке активных центров WGA хитотриозой не удалось полностью ингибировать влияние фитолектина на поведение Sp245. В пределах колонии, сформированной бактериями в присутствии WGA и хитотриозы, встречаются агрегаты, хотя и не в таком количестве, как в случае среды, содержащей только лектин (рис. 10). WGA обладает способностью связываться с нейраминовой кислотой. Это может частично объяснить образование клеточных агрегатов в присутствии WGA с заблокированными центрами связывания хитотриозой. Только хитотриоза не способствует распространению клеток Sp245 с образованием агрегатов, но влияет на форму формируемых колоний (рис. 10). Возможно, на полужидкой MSM с малатом хитотриоза является дополнительным источником углерода, и, как следствие этого, бактерии, скорее всего, перемещаются как по градиенту малата, так и хитотриозы.

Замена малата в полужидкой MSM, содержащей WGA или STA, на такие источники углерода, как сукцинат, арабиноза или фруктоза, не влияла на морфологию макроколоний, формируемых штаммом Sp245.

Вероятно, переход азоспирилл от Swa–подвижности к Gri–распространению, в присутствии лектинов со сродством к остаткам N–ацетил–?–D–глюкозамина является следствием снижения подвижности бактерий при помощи жгутиков (см. пункт 3.11.1) и возможных изменений межклеточных взаимодействий, необходимых для роения.

3.12 Формирование биопленок A. brasilense на абиотических поверхностях. Методом солевой агрегации проведена оценка суммарной относительной гидрофобности планктонных клеток A. brasilense Sp245 и его мутантов по синтезу полисахаридов и подвижности: KM018, KM127, KM134, KM139, KM252, KM348, SK048, SK051, SK248 и SK454, инкубированных ~20 ч в жидкой LB. Гидрофобность выращенных клеток всех исследованных штаммов существенно не различается. У мутанта A. brasilense Sp245.5 радикальное изменение структуры ЛПС и утрата ПССК (Кацы с соавт., 2002; Федоненко с соавт., 2010) сопровождается небольшим, но статистически достоверным, увеличением гидрофобности клеточной поверхности. Не исключено, что в случае Sp245.5 начальный этап взаимодействия с гидрофобной средой протекает быстрее, чем у других штаммов. У остальных штаммов, по-видимому, гидрофобные силы вносят примерно одинаковый вклад в прикрепление клеток к твердой поверхности.

В первые 24–48 ч инкубации бактерий в жидкой среде LB на поверхности пробирок или лунок планшетов формировались тонкие пленки, при микроскопии которых просматривались разрозненные клеточные агрегаты (микроколонии), легко смываемые при аспирации суспензий и промывании планшета или пробирки водой. Через 72–96 ч инкубации микроколонии сливались в достаточно прочную и плотную пленку с более ровной поверхностью.

С использованием окрашивания бактерий кристаллическим фиолетовым осуществлено сравнение биомассы в пленках (рис. 11), формируемых Sp245 и его мутантами за 96 ч на границе раздела фаз “жидкость (LB) – твердая гидрофильная поверхность (стекло)” и “жидкость (LB) – твердая гидрофобная поверхность (полистирол)”. На гидрофильной поверхности примерно равноценные биопленки КМ127, КМ134 и КМ348 (LpsI?) и КМ252 (Cal? LpsI?) лучше выражены, чем у штамма дикого типа. Возможно, это объясняется изменением заряда клеток названных мутантов вследствие утраты кислого ЛПСI. Толщина пленок, формируемых Sp245, KM124, KM134, KM139 и KM348 на гидрофобной среде, не имеет существенных различий, что согласуется с примерно одинаковой гидрофобностью их клеток. На поверхности полистирола Cal? LpsII? Mot? Swa?–мутант КМ018 и Cal? LpsI?–мутант КМ252 образуют более тонкие пленки. Общей характеристикой КМ018 и КМ252 является утрата ПССК. Биопленки, образуемые на гидрофобной и гидрофильной среде Cal? LpsI? LpsII?–мутантом Sp245.5, обладающим радикально измененной структурой клеточной поверхности, толще, чем у штамма Sp245 и его омегоновых мутантов (рис. 11). У SK051 (leaky Fla? Laf? Mot? Gri+ Cal?) толщина пленок, формируемых как на стекле, так и на полистироле, была менее выраженной. Пример мутантов KM018 и SK051 показывает, что одновременное нарушение в продукции и функционировании жгутиков и синтезе полисахаридов приводит к тому, что клетки значительно хуже формируют биопленки как на гидрофильной, так и на гидрофобной поверхности. У Mot? Gri+-мутанта SK248 биопленки окрашиваются на уровне Sp245 как на стекле, так и на полистироле. Вероятно, в стационарной культуре полярный жгутик в большей степени определяет прикрепление бактерий к поверхности, а не подвижность клеток в составе пленки. У мутантов SK048 (Fla? Mot? Gri+) и SK454 (Fla? leaky Laf? Gri+) на стекле биопленки образуются хуже, чем у дикого типа. Однако на полистироле они, как и SK248, формируют биопленку на уровне Sp245.

Общий уровень выявления полисахаридных антигенных детерминант в биопленках (для сравнения количества антигенов использовали иммуноферментный анализ (ИФА), используя Ат на ЛПС Sp245), образуемых на гидрофобной поверхности Sp245 и мутантов KM127, KM134 и KM348, и KM252, различается несущественно. В то же время планктонные клетки этих LpsI?–мутантов взаимодействуют с антителами менее эффективно, чем Sp245. С учетом примерно равного количества биомассы (см. рис. 11) в биопленках Sp245 и KM127, KM134, KM348 можно предположить, что при взаимодействии с твердой поверхностью в клетках перечисленных мутантов активируется синтез полисахаридов. В случае штамма KM252 уровень продукции полисахаридов, очевидно, повышается в еще большей степени. Общее количество полисахаридных антигенов, продуцируемых LpsII?–мутантом KM139 в бульонной культуре и биопленках, значительно выше, чем у других штаммов. Различия в уровне продукции белковых антигенов, выявляемых в биопленках Sp245, KM127, KM139, KM252, KM348 и Sp245.5, не существенны. У мутантов KM018 и KM134 количество экспонированных белковых антигенов снижено по сравнению с другими штаммами; однако в случае KM018 это снижение коррелирует с меньшей толщиной биопленки.

В результате проделанной работы установлено, что сохраняющие жгутиковую подвижность LpsI?–штаммы образуют более толстые биопленки на гидрофильной поверхности. Мутанты с нарушениями в продукции ПССК формируют менее выраженные биопленки на твердой гидрофобной поверхности. Дефекты в продукции ПССК в совокупности с утратой жгутиковой подвижности негативно сказываются на способности азоспирилл к закреплению на гидрофобной и гидрофильной поверхности. Утрата LpsII при сохранении ПССК не приводит к изменениям в поведении мутантов на гидрофобной поверхности – по-видимому, за счет повышения уровня продукции других полисахаридов. Радикальная перестройка в структуре полисахаридных антигенов коррелирует с активизацией процесса формирования биопленок соответствующего мутанта (Sp245.5) на разнообразных поверхностях. Таким образом, липополисахариды и полисахариды, связывающие калькофлуор, участвуют в структурной организации биопленок азоспирилл на границе раздела фаз “водная среда – твердая гидрофильная поверхность” и “водная среда – твердая гидрофобная поверхность”. Для формирования азоспириллами устойчивой биопленки продукция латеральных жгутиков, скорее всего, не является существенной. Мутанты Sp245, образующие биопленку со сходной биомассой, различаются по продукции Laf, например, KM018 (Cal? LpsII? Mot?) и SK051 (leaky Fla? Laf? Mot?) или SK048 (Fla? Mot?) и SK454 (Fla? leaky Laf?). В тоже время отсутствие полноценного полярного жгутика может существенно влиять на образование биопленок.

Как оказалось, спонтанные (как у мутанта Sp245.5) или индуцированные (как у штаммов KM018, KM127, KM134, KM139, KM252, KM348, SK048, SK248 и SK051) изменения состава и (или) структуры плазмид A. brasilense Sp245 оказывают заметное влияние на социальную активность этих бактерий, проявляющуюся, в частности, в формировании биопленок.

3.13 Изменения в подвижности бактериальных клеток при их первичном контакте с потенциальным партнером на примере взаимодействия A. brasilense и базидиомицета Grifola frondosa (Fr.) S.F. Gray. При изучении свойств лектина, выделенного с поверхности мицелия базидиального ксилотрофа G. frondosa (Fr.) S.F. Gray 0917, авторами была установлена его необычная углеводная специфичность к ОПС ЛПС A. brasilense Sp245 (Степанова с соавт., 2007), представляющему собой линейный D–рамнан (Fedonenko et al., 2002). Совместное культивирование G. frondosa 0917 с бактериями штамма A. brasilense Sp245 дикого типа или его мутантами по синтезу полисахаридов показало, что присутствие азоспирилл в кокультуре сказывалось на росте мицелия в целом положительно. Однако в случае совместной культуры со штаммами КМ018 и КМ139 зона первичного контакта по периметру подсева представлена характерным кольцом воздушного редкого мицелия. В случае штаммов КМ252 и КМ348 во всех опытах такая зона была более выраженной, что можно трактовать как более резкое проявление антагонизма. Это еще очевиднее, если сравнить указанные смешанные культуры с чистой (контрольной), морфологически однородной культурой гриба, а также с совместной культурой гриба с диким штаммом Sp245, которая по морфологии практически ничем не отличается от контрольной. Заметные различия в морфологии кокультур наблюдали в опытах с предобработкой растущих гиф препаратом ОПСI перед подсевом бактериальных культур, по сравнению с опытами по их совмещению без предобработки. Возможным объяснением наблюдаемых эффектов является блокировка лектина ОПСI, что в конечном итоге привело к временному затруднению в контакте гиф с бактериями. Но в процессе дальнейшего роста выработка лектина растущими гифами привела к распознаванию и более скорой “идентификации” штаммов Sp245, КМ018 и КМ139 по сравнению со штаммом КМ252 и КМ348, у которых зона противостояния гораздо ярче выражена, чем в остальных случаях.

Мицелиальный лектин G. frondosa 0917 замедляет индивидуальную подвижность клеток A. brasilense Sp245 (рис. 12). Исследование подвижности бактерий мутантов КМ139, КМ252 и КМ348 до и после их инкубации с лектином в концентрации 10 мкг/мл показало, что под влиянием лектина подвижность КМ139 замедляется. В случае КМ252 и КМ348 этого не происходит. Вероятно, лектин G. frondosa 0917 вызывает замедление индивидуальной подвижности азоспирилл только у тех штаммов, в ЛПС которых экспонирован ОПСI, являющийся гаптеном лектину.

Таким образом, штаммы A. brasilense Sp245, КМ018 и КМ139, в клеточной стенке которых экспонирован ОПСI, являющийся гаптеном грибного лектина, распознаются грибом с наименьшим проявлением антагонизма. При этом лектин влияет на подвижность бактерий, что свидетельствует об участии специфических лектин–углеводных взаимодействий в первичном контакте мицелия G. frondosa и A. brasilense в процессе совместного культивирования. Бактериальные штаммы, клетки которых снижают скорость движения в жидких средах в присутствии лектина G. frondosa, “распознаются” грибом с наименьшим проявлением антагонизма.

3.14 Колонизация корней пшеницы A. brasilense с различиями в социальной подвижности. Исследована динамика колонизации корней пшеницы штаммом A. brasilense Sp245 и его Swa? Gri+–мутантами. Начальные этапы колонизации азоспириллами корневой системы растений зависят от способности бактерий перемещаться по направлению к корням растения (Steenhoudt, Vanderleyden, 2000). Данное обстоятельство обусловило наш выбор условий инокуляции (с покачиванием инкубационных сосудов), обеспечивающих штамму дикого типа и его мутантам по жгутикованию и подвижности равные шансы на контакт с поверхностью корня. Через сутки после инокуляции определяли количество бактерий, “заякоривающихся” на корнях проростков. На седьмые сутки после инокуляции в корневой системе пшеницы увеличивается количество разветвленных корней, по сравнению с контрольными образцами, что служит индикатором позитивного влияния бактерий.

В выбранных условиях после 3 ч инкубации суспензии бактерий с трехсуточными проростками количество бактерий, прикрепившихся к корням, стабилизировалось. Мутанты SK048, SK051 и SK454 имели сниженную по сравнению с Sp245 способность к адсорбции на корнях (рис. 13). Мы не обнаружили у штамма Sp245 и использованных мутантов различия в продукции или антигенной структуре поверхностных углеводных полимеров. Исключение представляет SK051, в отличие от других штаммов имеющий Cal? фенотип. Гидрофобность клеток дикого и мутантных штаммов существенно не различается. Таким образом, на этапе прикрепления к корням пшеницы клеток всех исследованных штаммов гидрофобные силы и полисахаридные компоненты клеточной поверхности, по–видимому, вносят примерно одинаковый вклад. Сниженная по сравнению со штаммом Sp245 способность клеток мутантов к адсорбции на корнях может быть обусловлена отсутствием у них Fla.

Через сутки на корнях “заякоривалось” ~30% адсорбировавшихся клеток Sp245. В случае мутантов SK048, SK051 и SK454 на корнях остается, соответственно, ~59, 44 и 21% клеток (рис. 13). Высевы с 10–дневных проростков показали, что после “заякоривания” бактерий на растении численность популяций штамма Sp245 и его мутантов возрастает примерно в одинаковой степени (рис. 13). Наблюдаемое снижение численности азоспирилл на корнях растущих проростков можно объяснить миграцией в среду для выращивания растений части адсорбировавшихся клеток. Это предположение было подтверждено результатами высевов бактерий из сред после извлечения растений.

Таким образом, динамика колонизации проростков пшеницы мутантами и родительским штаммом свидетельствует о том, что после “заякоривания” клеток механизм распространения с образованием микроколоний (Gri+-фенотип) может достаточно эффективно обеспечить заселение бактериями растущих корней. Стоит отметить, что увеличение количества разветвленных корней у 10–дневных проростков, инокулированных клетками Sp245 или его мутантов, не зависит от количества бактерий, изначально адсорбировавшихся на растении.

Предположение о реализации у азоспирилл, заселяющих корни проростков пшеницы, механизма распространения с образованием микроколоний подтверждают микроскопические наблюдения. На этапе инокуляции в случае штамма Sp245 адсорбировавшиеся на корневых волосках бактерии располагались равномерно, без предпочтительного группирования в какой-либо зоне. В случае инокуляции штаммами SK048, SK051 и SK454 встречались корневые волоски, заселенные бактериями, располагающимися вдоль волоска в виде агрегатов. Уже через 24–48 ч после инокуляции растений клетки штамма Sp245 обнаруживались на корнях в виде агрегатов наряду с равномерно распределенными особями. На седьмые сутки агрегаты клеток, оставшихся на поверхности корня, образовывали скопления в случае проростков, заселенных как штаммом Sp245, так и мутантами SK048, SK051 и SK454.

Формирование азоспириллами агрегатов в процессе их распространения по корневой системе растения, вероятно, является следствием воздействия на бактериальную популяцию определенных внешних факторов. Например, в полужидких средах с агглютинином зародышей пшеницы часть популяции Sp245 переходит от роения к распространению с образованием микроколоний. Дополнительным стимулом, обеспечивающим переход бактерий к Gri-распространению in planta, может стать недостаток кислорода, поскольку в опытах in vitro предварительное культивирование в условиях дефицита кислорода приводило к увеличению количества Swa? Gri+–клонов в популяции клеток штамма Sp245.

Через неделю после инокуляции проростков пшеницы скопления клеток штамма Sp245 или его мутантов выявляли на поверхности корня и корневых волосков и при иммунофлуоресцентной микроскопии (рис. 14). Флуоресценция комплекса ФИТЦ–меченных Ат (ослиные антикроличьи Ат, конъюгированные с флуоресцеинизотиоцианатом) с антителами к полисахаридам штамма Sp245 (Ат 1) или антителами, выявляющими белковые структуры (Ат 2), наблюдалась на корнях отдельными светящимися участками. Комплекс Ат 1 или Ат 2 с ФИТЦ–меченными антителами позволил выявить бактерии, находящиеся в корневых волосках 10–дневных проростков, инокулированных как клетками штамма Sp245, так и SK048, SK051 или SK454 (рис. 14). На трехдневных проростках с только что адсорбированными клетками значительные скопления бактерий удалось визуализировать лишь при использовании антител к полисахаридам. При применении антител на бактериальные белковые антигены сигнал флуоресценции наблюдали только у редких групп бактерий среди большого количества клеток, адсорбировавшихся на поверхности корней трехдневных проростков. Таким образом, в случае прикрепившихся азоспирилл белковые структуры выявляются Ат 2 в меньшей степени, чем у бактерий, адаптировавшихся к существованию на растении. Необходимо отметить, что сигнала в контролях не наблюдали.

Таким образом, результаты иммунофлуоресцентной микроскопии свидетельствуют, что полисахаридные и белковые детерминанты могут участвовать в организации биопленок на корнях пшеницы, как и в случае образования азоспириллами биопленок на границе раздела фаз “водная среда – твердая гидрофильная или гидрофобная поверхности”. По-видимому, бактериальные гликополимеры и белки обеспечивают не только прикрепление бактериальной биопленки к поверхности корня (Rodriguez–Navarro et al., 2007), но и участвуют в организации ее строения, вовлекая в этот процесс факторы растительного происхождения, в том числе, и способствующие переходу азоспирилл к микроколониальному распространению. Одной из стадий формирования биопленки и на стекле или полистироле также является образование клеточных агрегатов, но в дальнейшем микроколонии сливаются в единый слой клеток. Напротив, на поверхности корня после “заякоривания” бактерий их расположение в составе микроколоний преобладает.

Иммунофлуоресцентная микроскопия с антителами на антигены клеточной поверхности бактерий позволила выявить экспонированные полисахаридные или белковые детерминанты у азоспирилл, находящихся непосредственно на корне проростков пшеницы. Иммуноферментный анализ и параллельный подсчет КОЕ использовались для обнаружения возможных изменений в содержании полисахаридных и белковых антигенов при адаптации азоспирилл к существованию на корнях растений.

В ИФА с Ат 1 на клетках штаммов A. brasilense Sp245, SK048, SK051 и SK454 из культур, использованных для инокуляции растений, выявляется сходное количество полисахаридных детерминант. Какие-либо различия в иммунохимических характеристиках ЛПС исследованных штаммов азоспирилл также не были обнаружены. Результаты иммунофлуоресцентной микроскопии инокулированных корней проростков пшеницы, подсчета КОЕ в гомогенатах инокулированных корней (рис. 13а) и ИФА этих же гомогенатов (рис. 13б) свидетельствуют о том, что в течение недели вариации в содержании полисахаридов, узнаваемых Ат 1, соответствуют изменениям в количестве заселивших корни клеток дикого и мутантных штаммов

Иммунохимический анализ белков, выделенных с поверхности клеток штамма Sp245 и его Fla? Swa? Gri+–мутанта SK048, распространяющихся в полужидком агаре, выявил один и тот же мажорный антиген в составе данных препаратов. При этом, в отличие от препарата Sp245, на иммуноэлектрофореграмме препарата SK048 наблюдается двойной пик, сформированный линиями преципитации, что может быть следствием существования двух изоформ соответствующего антигена. В ИФА с Ат 2 ночных культур бактерий, использованных для инокуляции растений, у штаммов Sp245 и SK051 выявляется примерно одинаковое, а у SK048 и SK454 незначимо меньшее количество экспонированных белковых детерминант. Незначительное увеличение количества белковых детерминант, экспонированных на клетках штаммов Sp245, SK048, SK051 и SK454 через 7 суток после инокуляции проростков пшеницы, статистически недостоверно (рис. 13б). Численность клеток штамма Sp245 на корнях за это же время снижается практически на порядок, а в случае мутантов SK048, SK051 и SK454 данный показатель сохраняется примерно на исходном уровне. Эти результаты являются косвенным свидетельством того, что при адаптации к корням растений в клетках штамма A. brasilense Sp245 заметно активизируется синтез белковых детерминант, узнаваемых Ат 2.


загрузка...