Генетико-физиологические аспекты социального поведения ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense (27.09.2010)

Автор: Шелудько Андрей Вячеславович

KM134 LpsI? Swa++

KM139 LpsII? Swa++

KM252 Cal? LpsI? Swa+

KM348 LpsI? Swa++

SK048 Fla? Mot? Swa? Gri+

SK051 Leaky Fla? Laf? Mot? Swa? Gri+

p85::pJFF350, p120 и три плазмиды с молекулярной массой более 300 МДа

SK248 Mot? Swa? Gri+

BK570 Swa++

BK571 Swa++

BK759G Fla? Swa? Gri+

BK759P Fla+ Swa++ 36-МДа плазмида, p120 и три плазмиды с молекулярной массой более 300 МДа

BK468 Swa++

p85, p120 и три плазмиды с молекулярной массой более 300 МДа

SK005 Fla? Laf? Mot? Swa? Gri+

SK039 Leaky Fla? Mot? Swa? Gri+

SK237 Fla? Swa? Gri+

SK454 Fla? leaky Laf? Swa? Gri+

SK531 Fla? Laf? Mot? Swa?

SK586 Fla? Laf? Swa?

KZ019 Fla? Swa?

p120 и три плазмиды с молекулярной массой более 300 МДа

KZ020 Leaky Fla? Mot? Swa?

KZ044 Fla? Swa?

KZ042 Swa++ p85::pSUP5011, p120 и три плазмиды с молекулярной массой более 300 МДа

KZ050 Swa++

Примечание: * – диффузная колония.

В главе 2 описаны: питательные среды и условия выращивания бактерий, гриба и проростков пшеницы; методы изучения ряда биохимических, физиологических и морфологических характеристик бактериальных культур; иммунохимические методы анализа различий в продукции бактериями полисахаридов и белков; методы анализа ДНК и свойств предсказанных белковых продуктов кодирующих последовательностей. Все количественные результаты подвергали статистической обработке с использованием пакета Microsoft Office Excel 2003 (11.6355.6360) SP1. Доверительные интервалы определяли для 95% уровня значимости.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Индивидуальная и социальная подвижность азоспирилл, зависящая от работы жгутиков. Выросшие в жидкой среде азоспириллы синтезируют длинный жгутик (Fla), располагающийся на одном из полюсов клетки. Активность Fla обеспечивает возможность клеткам штамма Sp245 плавать прямолинейно вдоль их длинной оси со средней скоростью 29.0±1.1 мкм/с. После точечного посева в агаризованную питательную среду клетки Sp245 переходят к роению при помощи жгутиков и формируют макроколонию, имеющую вид концентрической структуры (Swa+–фенотип, от англ. swarming) (рис. 1). Внимание к поведению азоспирилл на полужидких агаризованных средах обусловлено возможностью в данных условиях смоделировать физико-химические свойства муцигеля (Скворцов, 1994), окружающего бактерии на корнях растения. Стоит отметить, что использование агаризованных сред позволяет выявить у бактерий способность к различным типам коллективной подвижности, опосредуемым не только жгутиками, но и обусловленными другими механизмами (Henrichsen, 1972). Формирование роящимися клетками на средах, содержащих от 0.4–0.6% агара, концентрических макроколоний у штамма Sp245 происходит после 2.5–5-часового латентного периода и сопровождается увеличением на 15–20% продольного размера клеток и, как и у других штаммов A. brasilense (Moens et al., 1995), синтезом дополнительных латеральных жгутиков (Laf). Концентрические макроколонии образуют роящиеся бактерии всех штаммов, исследованных нами, – представителей A. brasilense, A. halopraeferans, A. irakense и A. lipoferum, что позволяет определить описанную морфологию колоний как характерную для рода Azospirillum. Отчасти это может быть обусловлено формой клеток азоспирилл и характером расположения на них жгутиков.

Получены производные штамма A. brasilense Sp245, распространяющиеся по полужидким средам со скоростью коллективной миграции клеток, превышающей подвижность родительского штамма (Swa++–фенотип), а также мутанты, утратившие способность к жгутиковой подвижности (Swa?–фенотип) (табл. 1, рис. 1). Например, штамм BK570, клетки которого распространяются в малатно-солевой среде (MSM) с 0.3 или 0.4% агара примерно в 2 раза быстрее, чем у штамма Sp245 (рис. 1). Клетки BK570 движутся активнее Sp245 также и в жидкой среде (34.8±1.0 и 29.0±1.1 мкм/с, соответственно). Различия в поведении Swa++–, Swa?–мутантов не зависели от использованного источника углерода или азота в среде.

Считается, что именно активность Laf обеспечивает роение азоспирилл на агаризованных средах. Однако в отличие от сохраняющего подвижность на полужидких средах Fla? Laf+–мутанта A.brasilense Sp7 (Hall, Krieg, 1983), полученные нами Fla? Laf+, Fla?/Mot? Laf+ и Mot? Laf+ Omegon–Km–мутанты (SK039, SK048 и SK248) штамма Sp245, а также Fla? leaky Laf? мутант SK454, синтезирующий Laf в меньшем количестве, не способны к роению с образованием концентрических макроколоний. Fla? leaky Laf? (KZ019 и KZ044) и Mot? leaky Fla? Laf+ (KZ020) Tn5–Mob –мутанты мутанты Sp245, а также TnphoA Fla? Laf+ (KS107 и KS122) и Fla? leaky Laf? (KS109) мутанты A. brasilense S27 тоже не способны к роению. Результаты изучения поведения в полужидких средах Fla? Laf+/Fla? leaky Laf? производных A. brasilense Sp245 и S27 и данные по подвижности аналогичных мутантов штамма Sp7 (Hall, Krieg, 1983) свидетельствуют о том, что мы наблюдаем некоторые внутривидовые различия, характеризующие роль Laf в обеспечении подвижности азоспирилл на агаризованных средах. По крайней мере, у двух штаммов, A. brasilense Sp245 и S27, и Fla обеспечивает распространение бактерий по полужидким средам.

3.2 Миграция A. brasilense с образованием микроколоний, не зависящая от жгутиков. Наблюдения за поведением одного из Swa?–мутантов штамма Sp245, SK048 (Fla? Mot?) позволили нам выявить скрытый потенциал, обеспечивающий распространение азоспирилл по полужидким средам. Бактерии дикого типа за 18 ч инкубации образуют концентрические колонии. Клетки мутанта более 18 ч остаются в точке инокуляции (Swa?–фенотип), а затем начинают перемещаться, формируя небольшие диски, состоящие из клеточных агрегатов – Gri–распространение (от англ. granular inclusions) (рис. 2). Как правило, морфология макроколоний соответствует определенному способу социальной подвижности микроорганизмов (Henrichsen, 1972). Возможно, изменение морфологии макроколоний у SK048 обусловлено использованием клетками способа коллективной миграции, скрытытого у дикого типа в лабораторных условиях, но ставшего единственным способом распространения мутанта.

Способность к Gri–распространению удалось обнаружить не только у мутанта SK048, но и у ряда других Swa?–производных штамма Sp245. Инокулированные с плотной MSM в среды, содержащие от 0.2 до 0.9% агара, клетки омегоновых Swa?–мутантов (SK005, SK039, SK048, SK051, SK237, SK248, SK454, SK531, SK586, KM018, BK759G), в отличие от роящихся штаммов Sp245 и BK570, либо остаются в месте укола, либо образуют зернистые зоны распространения. В случае SK248 бактерии остаются в точке инокуляции в полужидкий агар, но иногда образуют зернистые или смешанные мутно-зернистые колонии. В полужидкой MSM мутанты SK005 (Fla? Laf? Mot?), SK039 (leaky Fla? Mot?), SK048 (Fla? Mot?), SK051 (leaky Fla? Laf? Mot?), SK237 (Fla?), SK248 (Mot?), SK454 (Fla? leaky Laf?) и KM018 (Cal? LpsII? Mot?) демонстрировали фенотипическую вариацию (либо Swa? Gri?, либо Swa? Gri+–фенотип) при одной и той же температуре независимо от концентрации (от 0.2 до 0.6%) агара и используемого источника углерода. В случае SK531 (Fla? Laf? Mot?) и SK586 (Fla? Laf?) клетки преимущественно оставались в точке инокуляции – Swa? Gri?–фенотип колоний. При концентрации агара в среде выше 0.6% все использованные в эксперименте штаммы к 48 ч инкубации либо остаются в месте инокуляции, либо начинают распространяться, но не в толще и не по поверхности агара, а по дну чашки Петри, если там имеется немного влаги. Стоит отметить, что клетки штамма дикого типа, мигрирующие по дну чашки Петри, также иногда распространяются с образованием микроколоний. Не исключено, что дефицит кислорода, который будет возникать под толщей агара, может способствовать переходу клеток Sp245 к Gri–подвижности. Причина такого перехода может быть обусловлена подавлением подвижности при помощи жгутиков в условиях недостатка кислорода. Так, у A. brasilense вращение полярного жгутика обеспечивается трансмембранной разностью потенциалов Na+ (?µNa+), в создании которой существенную роль играет активируемая дыханием натриевая помпа (Wood et al., 1998).

Период, предшествующий Gri–распространению, например, у штаммов A. brasilense SK048, SK039, SK051, SK248 и SK454 длится около 24–42 ч. Мутанты не отличаются от дикого типа в скорости роста. По-видимому, у Gri+–мутантов, активация генов, обеспечивающих Gri–распространение, происходит при достижении определенной плотности популяции бактерий через стадию неподвижных особей. На средах с концентрацией агара от 0.4% и выше на клетках штаммов Sp245, SK039, SK048 и SK248 синтезируются многочисленные Laf. У SK454 Laf образуются в меньшем количестве, а у SK051 Laf отсутствуют. Однако диаметр Gri+–колоний, образуемых мутантами, не зависел от присутствия Laf или от их количества. Так, у SK039, SK048, SK248, SK454 и SK051 через 48 ч инкубации на полужидкой MSM с 0.4% агара размер колоний составлял 7.1±0.8, 10.7±1.3, 7.3±0.9, 10.4±1.0 и 8.0±0.7 мм, соответственно. Таким образом, на способность к Gri+–распространению и эффективность такого способа миграции бактерий не влияет присутствие на клетках Laf. В пользу данного предположения свидетельствует поведение в полужидких средах клеток KZ019, KZ020 и KZ044 – Tn5–Mob–мутантов A. brasilense Sp245. Сохраняя способность к синтезу Laf, клетки мутантов KZ019, KZ044 (Fla? leaky Laf?) и KZ020 (Mot? leaky Fla?) на полужидких средах неподвижны (Swa? Gri?–фенотип), как и омегоновые мутанты SK531 (Fla? Laf? Mot?) и SK586 (Fla? Laf?), лишенные Laf.

Мы не наблюдали заметных различий в морфологии колоний у Sp245 и его Gri+–мутантов, выращенных на плотных средах MSM или LB. Большинство мутантов не отличались от штамма Sp245 дикого типа по продукции О–специфических полисахаридов (ОПС) и полисахаридов, связывающих калькофлюор (ПССК) (Cal+–фенотип). Исключением являлись SK051 имеющий Cal?–фенотип, а также Cal?–штамм KM018, утративший один из липополисахаридов (ЛПСII). Однако ряд других мутантов (KM127, KM139, KM252 и KM139) с изменениями в продукции ОПС и ПССК сохраняли способность к плаванию и роению. Таким образом, у Gri+–мутантов способ распространения с образованием микроколоний не связан с какими-либо общими дефектами в продукции полисахаридов, локализованных на клеточной поверхности.

Анализ поведения A. brasilense Sp245 и его Swa?–мутантов на полужидких средах свидетельствует, что утрата способности к роению мутантами Sp245 с нарушениями продукции и функционирования жгутиков позволила обнаружить у A. brasilense способ распространения с образованием микроколоний, который скрыт у штамма дикого типа. Вероятно, для реализации механизма Gri–распространения бактерии не используют жгутики. Интересно, какие же клеточные структуры могут способствовать миграции бактерий и формированию агрегатов. Просвечивающая электронная микроскопия клеток SK048, выращенных на плотной среде, показала наличие пучка пилей на одном из полюсов клетки. Необходимо отметить, что хотя в жидких аэрируемых культурах около 10% клеток SK048 все еще продуцировали длинный или укороченный Fla (Шелудько, 2000), мы никогда не наблюдали Fla у бактерий SK048, выросших на плотной среде. Пучок пилей был также обнаружен на полюсе клеток других омегоновых мутантов и самого штамма Sp245, выращенных в жидкой или на плотной среде. Необходимо отметить, что визуализировать пили было довольно сложно, возможно, из-за их хрупкости. Расположение обнаруженных на клетках азоспирилл пилей соответствует локализации образующих полярный пучок пилей Bfp (от англ. bundle–forming pilus). Bfp обеспечивают тянущую подвижность Pseudomonas aeruginosa и ряда других грам–отрицательных бактерий, скольжение почвенных бактерий Myxococcus xantus и требуются для агрегации клеток (Henrichsen et al., 1972; Harshey, 2003). При световой микроскопии мы наблюдали характерные для тянущей подвижности подергивания клеток у SK048 в капельке жидкости, выдавленной из плотной среды, на которой рос мутант, после наложения на колонии покровного стекла. Подергивания клеток, сопровождающиеся изменением их положения в пространстве, отмечены нами и при микроскопии Gri–колоний, например, SK048, SK051, SK248 или SK454, сформированных бактериями в полужидкой среде.

Мы ни разу не наблюдали Fla и полярные пили на одной и той же клетке при просмотре препаратов для просвечивающей электронной микроскопии клеток, выращенных на плотной среде или в жидкой культуре. Вероятно, продукция на полюсе клетки либо вращающегося Fla, либо пилей являются альтернативными состояниями вегетативных клеток азоспирилл. Необходимо отметить, что распространение с образованием микроколоний наблюдалось в случае мутантов A. brasilense Sp245 (SK005, SK039, SK048, SK051, SK237, SK248, SK454, KM018, BK759G), у которых Fla либо не продуцировался, либо был парализован. Кроме того, при предварительном культивировании родительского штамма в статичных условиях, неблагоприятных для работы Fla, наблюдается пусть незначительное, но увеличение частоты перехода азоспирилл к Gri+–распространению (см. ниже). Возможно, собственно вращающийся Fla или иные компоненты функционирующей Fla–системы каким-то образом вовлечены в регуляцию частоты фенотипической вариации у A. brasilense. Также не исключено, что у систем, обеспечивающих Swa– или Gri–подвижность, существуют общие контролирующие элементы, поскольку среди мутантов A. brasilense Sp245 с различными нарушениями в продукции и функционировании жгутиков встречаются Swa? Gri?–штаммы (SK531, SK586, KZ019, KZ020 и KZ044). К настоящему времени в литературе появились сообщения, свидетельствующие о том, что у азоспирилл в геноме присутствуют локусы, обуславливающие синтез пилей (Кацы, 2002а; Valverde et al., 2006).

Наблюдения за поведением Sp245 и его Swa?–мутантов на полужидких средах позволили обнаружить у азоспирилл способ распространения с образованием микроколоний, скрытый у штамма дикого типа, что может быть обусловлено как большей скоростью миграции Swa+–клеток (рис. 2), так и доминированием в популяции Sp245 роящихся особей. Возможно, тестирование подвижности в полужидких средах отдельных бактериальных клонов позволит охарактеризовать фенотипические вариации в способах распространения Sp245. Оказалось, что после инокуляции в полужидкую MSM (0.4% агара) отдельных колоний Sp245 с плотной MSM через 48 ч шесть (3*10?3) из 1814 клонов демонстрируют Gri+–фенотип. Необходимо отметить, что мы наблюдали синтез Bfp не только у Swa?–мутантов, но и у клеток дикого типа. Восемьдесят одна колония (5*10?2) вообще не распространилась в агаре (Swa? Gri?), а другие клоны образовали кольца роения. Проверка стабильности выявленных производных Sp245 показала, что в использованных нами лабораторных условиях клоны этого штамма со спонтанным Gri+ или Swa?–фенотипом оказались нестабильными (бактерии восстанавливали способность к роению). По описанной выше экспериментальной схеме было изучено поведение мутанта SK048 и отмечено появление Swa? колоний с частотой 1*10?1. Эти Swa?–колонии впоследствии дали начало Gri+ и Swa?–потомкам. Остальные колонии, образованные отдельными клонами SK048, были Gri+.

Образование клеточных агрегатов на корнях растений характерно для азоспирилл (Murthy, Ladha, 1987), но природа клеточных структур и механизмов, определяющих агрегацию бактерий, остается не выясненной. Не исключено, что в случае клонов, выделенных после колонизации штаммом Sp245 корней пшеницы (бактерии находились 7 суток или 21 день на растениях, росших в жидкой среде), Gri+–распространение станет преобладать. Однако анализ подвижности на полужидкой MSM клонов Sp245, выделенных после колонизации этим штаммом корней пшеницы, не подтвердил данное предположение – увеличивалось лишь число Swa? Gri?–колоний, высеянных с корней 24–дневных растений (10?1 клонов). Не исключено, что способ распространения A. brasilense в форме микроколоний, или клеточных агрегатов, является предпочтительным лишь при определенных условиях окружающей среды, например, в слизи, выделяемой корнями растений.


загрузка...