Генетико-физиологические аспекты социального поведения ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense (27.09.2010)

Автор: Шелудько Андрей Вячеславович

3. Изучить возможное влияние на подвижность азоспирилл ряда внешних факторов (состав среды культивирования; присутствие прижизненного красителя конго красного, корневых экссудатов проростков пшеницы, растительных и грибного лектинов, поликлональных антител на поверхностные полимеры бактериальных клеток).

4. Охарактеризовать нуклеотидную последовательность сегмента резидентной 85-МДа плазмиды штамма A. brasilense Sp245, мутагенез которого приводит к дефектам в жгутиковании и/или подвижности азоспирилл.

5. Провести анализ изменений в структуре генома A. brasilense Sp245, сопровождающихся вариациями в социальной подвижности этих бактерий.

6. Исследовать процесс формирования биопленок культурами штамма A. brasilense Sp245 и его мутантов с изменениями в структуре клеточной поверхности и подвижности на абиотических плотных средах и на корнях проростков пшеницы.

Научная новизна работы. Дана характеристика новых проявлений социальной подвижности азоспирилл: ускоренное роение, зависящее от работы жгутиков, и распространение в полужидких средах с образованием микроколоний, реализуемое и в отсутствие жгутиков. Описаны новые экстраклеточные органеллы бактерий штамма A. brasilense Sp245 – полярный пучок пилей, продукция которых, возможно, альтернативна сборке полярного жгутика.

Установлено, что социальная подвижность азоспирилл определяется не только аппаратом подвижности, но и межклеточными взаимодействиями, обусловленными поверхностными структурами, способными адсорбировать прижизненный краситель конго красный.

Показано, что межклеточные контакты бактерий A. brasilense Sp245, двигающихся в полужидких средах, опосредуются взаимодействиями белка-гемагглютинина и О-специфического полисахарида этих бактерий.

Определены некоторые факторы (сниженная концентрация кислорода, аминокислоты аспарагиновая кислота, серин и треонин и растительные лектины, специфичные к остаткам N-ацетил-?-D-глюкозамина, соли аммония, нитраты и нитриты), способствующие переходу части популяции клеток A. brasilense от плавания и роения к распространению с образованием микроколоний или оказывающие модулирующее действие на скорость движения клеток.

Обнаружено, что спонтанные или индуцированные изменения состава и (или) структуры плазмид A. brasilense Sp245 оказывают заметное влияние на социальное поведение бактерий. В ДНК 85-МДа плазмиды A. brasilense Sp245 идентифицированы гены hdfR и ccoN, предсказанные белковые продукты которых могут влиять на поведенческие реакции бактерий.

Выявлены поверхностные структуры бактерий и типы подвижности, участвующие в процессе формирования азоспириллами биопленок на границе раздела фаз “водная среда – твердая гидрофильная поверхность” и “водная среда – твердая гидрофобная поверхность” или на корнях проростков пшеницы.

Научно-практическая значимость работы. В данной работе представлены оригинальные мутанты штамма A. brasilense Sp245 с изменениями в индивидуальной и социальной подвижности, продукции жгутиков и поверхностных полисахаридов, которые могут быть полезны при изучении механизмов адаптации микроорганизмов к обитанию в различных экологических нишах, в том числе, в ассоциациях с растениями. Разработанные методические приемы и теоретические положения нашли применение в исследованиях, выполняемых в пяти лабораториях ИБФРМ РАН (генетики микроорганизмов, биохимии, микробиологии, иммунохимии и экологической биотехнологии), объектами которых были не только бактерии рода Azospirillum, но и бактерии других родов (что частично отражено в публикациях, представленных в списке основных публикаций по теме диссертации).

Предложенная биотест-система, основанная на ингибировании подвижности разных штаммов азоспирилл поликлональными антителами на поверхностные бактериальные структуры, может быть использована для первичной оценки серологического родства этих бактерий и степени экспонированности углеводных и белковых компонентов на поверхности интактных клеток.

Результаты работы использованы при подготовке учебно-методического пособия “Методы изучения бактериальной подвижности в приложении к биохимическим, генетическим и иммунохимическим задачам” / Составители: Шелудько А.В., Кацы Е.И., Матора Л.Ю., Бурыгин Г.Л., Широков А.А., Щеголев С.Ю. / Под ред. Игнатова В.В. Саратов: Научная книга, 2007. 56 с. Данное пособие, рекомендованное к печати кафедрой органической и биоорганической химии и кафедрой биохимии и биофизики Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского (СГУ), предназначено для студентов и аспирантов химического и биологического факультетов СГУ.

Положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Ускоренное роение и распространение в полужидких средах с образованием микроколоний представляют собой новые проявления социальной подвижности азоспирилл. Коллективное движение азоспирилл определяется не только аппаратом подвижности, но и межклеточными взаимодействиями, обусловленными поверхностными структурами, способными адсорбирировать прижизненный краситель конго красный.

2. Распространение бактерий A. brasilense Sp245 по полужидким средам опосредуется взаимодействием белка-гемагглютинина и О-специфического полисахарида. Источники азота в окружающей среде и кислород модулируют гемагглютинирующие свойства бактериальных клеток и, как следствие, подобные взаимодействия.

3. Сниженная концентрация кислорода, аспарагиновая кислота, серин, треонин и растительные лектины, специфичные к остаткам N-ацетил-?-D-глюкозамина, стимулируют переход части популяции клеток A. brasilense от плавания или роения к распространению с образованием микроколоний. На эффективность роения азоспирилл влияют природа источника азота в среде, концентрация кислорода и корневые экссудаты проростков пшеницы.

4. Генетические перестройки в 85-МДа плазмиде штамма A. brasilense Sp245 сопровождаются изменениями в жгутиковании и подвижности азоспирилл. На социальное поведение азоспирилл могут, в частности, влиять предсказанные белковые продукты выявленных в p85 генов hdfR и ccoN – негативный регулятор транскрипции жгутикового мастер-оперона flhDC и каталитическая субъединица I цитохромоксидазы, соответственно.

5. Изменения состава и (или) структуры плазмид A. brasilense Sp245 оказывают заметное влияние на эффективность формирования биопленок азоспирилл на абиотических поверхностях. Липополисахариды, полисахариды, связывающие калькофлуор, и полярный жгутик участвуют в организации биопленок A. brasilense на границе раздела фаз “водная среда – твердая гидрофильная поверхность” и “водная среда – твердая гидрофобная поверхность”.

6. После “заякоривания” на корнях пшеницы формирование биопленки клетками штамма A. brasilense Sp245 и его нероящихся мутантов опосредовано распространением с образованием микроколоний. В процессе адаптации к существованию на корнях у штамма A. brasilense Sp245 повышается количество экспонированных на клеточной поверхности родоспецифических белковых антигенов.

7. Бактериальные штаммы, клетки которых снижают скорость движения в жидких средах в присутствии чужеродного лектина, “распознаются” организмом, продуцирующим лектин, с наименьшим проявлением антагонизма.

8. Эффект ингибирования подвижности азоспирилл антителами на поверхностные структуры или лектинами различного происхождения может быть использован для оценки серологического родства бактерий и степени экспонированности углеводных и белковых компонентов на поверхности клеток.

Диссертационная работа выполнена в лаборатории генетики микроорганизмов (ЛГМ) ИБФРМ РАН в рамках трех плановых тем НИР: “Изучение генов почвенных азотфиксирующих бактерий, определяющих их взаимодействие со злаками” (№ госрегистрации 01960001676); “Изучение вклада плазмид в определение подвижности и образование мажорных компонентов клеточной поверхности у почвенных ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense” (№ госрегистрации 01200606181); “Изучение генетической регуляции социальной подвижности и образования мажорных компонентов клеточной поверхности у бактерий, ассоциированных с растениями” (№ госрегистрации 01200904390). Работа частично поддержана грантом Президента РФ МК-235.2003.04 для молодых кандидатов наук (канд. биол. наук А.В. Шелудько) и их научных руководителей (д-р биол. наук Е.И. Кацы); грантами Президента РФ НШ-1529.2003.4, НШ-6177.2006.4 и НШ-3171.2008.4 для ведущей научной школы засл. деятеля науки РФ, д-ра биол. наук, проф. В.В. Игнатова; грантом Роснауки № 2005-РИ-112/001 (рук. – д-р биол. наук, проф. В.В. Игнатов); грантом Фонда содействия отечественной науке для канд. биол. наук А.В. Шелудько и грантом Российского фонда фундаментальных исследований № 06-04-48204-а (рук. – д-р биол. наук Е.И. Кацы).

Личный вклад автора. Автору принадлежит решающая роль в планировании и осуществлении экспериментов, анализе и обобщении полученных результатов. Автор выражает искреннюю признательность своему научному консультанту – заведующей ЛГМ ИБФРМ РАН д-ру биол. наук Е.И. Кацы за многолетнюю помощь и всестороннюю поддержку работы. Автор признателен участвовавшим в проведении исследований сотрудникам ЛГМ ИБФРМ РАН канд. биол. наук Л.П. Петровой, канд. биол. наук И.В. Борисову, канд. биол. наук О.В. Кулибякиной и О.Э. Варшаломидзе; сотрудникам лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН д-ру биол. наук Л.Ю. Матора, канд. биол. наук Г.Л. Бурыгину и канд. биол. наук А.А. Широкову; сотрудникам лаборатории биохимии ИБФРМ РАН д-ру биол. наук Л.П. Антонюк, канд. биол. наук А.В. Тугаровой и В.А. Крестиненко; сотрудникам лаборатории микробиологии ИБФРМ РАН канд. биол. наук Л.В. Степановой, канд. биол. наук Е.Г. Пономаревой и канд. биол. наук Е.П. Ветчинкиной; сотруднику лаборатории физиологии растительной клетки ИБФРМ РАН канд. биол. наук М.К. Соколовой; чей вклад отражен в совместных публикациях; а также другим сотрудникам ИБФРМ РАН, способствовавшим успешному выполнению работы.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 5-й Школе-конференции молодых ученых “Горизонты физико-химической биологии” (Пущино, 2000), 10-м Международном конгрессе IUMS The “World of Microbes” (Париж, 2002), 1-й и 2-й Региональных конференциях молодых ученых “Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой” (Саратов, 2002, 2004), 6-й, 9-й и 10-й Школах-конференциях молодых ученых “Биология – наука XXI века” (Пущино, 2000, 2005, 2006), международной конференции “Biochemical Interactions of Microorganisms and Plants with Technogenic Environmental Pollutants” (Саратов, 2003), 3-й Всероссийской школе-конференции “Химия и биохимия углеводов” (Саратов, 2004), 30-м конгрессе FEBS (Будапешт, 2005), Всероссийской конференции “Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты” (Саратов, 2005), Международной научной конференции “Мiкробнi бiотехнологii” (Одесса, 2006), Международной школе-конференции “Генетика микроорганизмов и биотехнология” (Москва–Пущино, 2006), 3-й и 4-й Межрегиональных конференциях молодых ученых “Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой” (Саратов, 2006, 2008), Всероссийской конференции с международным участием “Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем” (Саратов, 2007), Международной научной конференции “Микроорганизмы и биосфера” (Москва, 2007), 5-м Всероссийском Конгрессе по медицинской микологии “Успехи медицинской микологии” (Москва, 2007), Международном рабочем совещании “Azospirillum VII and related PGPR: Genomics, molecular ecology, plant responses and agronomic significance” (Монпелье, 2007), Международной конференции “Вавиловские чтения–2007”, посвященной 120-летию со дня рождения Н.И. Вавилова (Саратов, 2007), Международной научно-практической конференции “Вавиловские чтения–2008”, посвященной 95-летию Саратовского госагроуниверситета (Саратов, 2008), 5-м Московском междунар. конгр. “Биотехнология: состояние и перспективы развития” (Москва, 2009), отчетных научных конференциях ИБФРМ РАН (Саратов, 2003, 2004, 2008).

Диссертационная работа обсуждена и одобрена на расширенном заседании лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН 09.06.2010, протокол № 175.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 40 работ, в том числе, 18 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ для опубликования основных научных результатов диссертаций на соискание ученых степеней доктора и кандидата наук.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 321 странице машинописного текста, содержит 24 таблицы и 54 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов собственных исследований (из 14 подразделов), а также заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 510 литературных источников, из них 80 на русском и 430 на английском языках. В приложении приведены аннотированные нуклеотидные последовательности обсуждаемых в работе генов 85-МДа плазмиды бактерий штамма A. brasilense Sp245, депонированные в международную базу данных GenBank (NCBI, США) (GenBank accession no. EU194339, EU784144, EU595702, EU595701 и EU595706).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Обзор литературы включает подразделы: 1.1 Общая характеристика ассоциативных бактерий рода Azospirillum; 1.2 Мажорные углеводсодержащие полимеры бактериальной поверхности; 1.3 Межклеточная коммуникация бактерий; 1.4 Двигательные органеллы бактерий; 1.5 Поведение бактерий, обусловленное подвижностью; 1.6 Формирование бактериями биопленок.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использованы бактерии штаммов дикого типа A. brasilense Cd, KR77, S17, S27, Sp7, Sp107, Sp245, SpBr14, SR8, SR15, SR55, SR75, SR80, UQ1794 и UQ1796, A. halopraeferans AU4, A. irakense KA3 и KBC1, A. lipoferum Sp59b, SpRG20a и SpRG6xx; 36 мутантов (табл. 1) и спонтанных производных A. brasilense Sp245; три мутанта A. brasilense S27 (KS107, KS109 и KS122); три штамма Escherichia coli; 11 рекомбинантных плазмид; а также растительный и грибной объекты – мягкая яровая пшеница Triticum aestivum cv. Саратовская 29 и базидиальный ксилотроф Grifola frondosa (Fr.) S.F. Gray 0917.

Таблица 1. Характеристика мутантов A. brasilense Sp245

Штамм Фенотип Характеристика плазмид

Sp245 Дикий тип p85, p120 и три плазмиды с молекулярной массой более 300 МДа

Sp245.5 Cal? LpsI? LpsII? Swa+ * четыре плазмиды с молекулярной массой более 300 МДа

KM018 Cal? LpsII? Mot? Swa? Gri+

p85, p120::Omegon–Km и три плазмиды с молекулярной массой более 300 МДа

KM127 LpsI? Swa++


загрузка...