Патогенетическое обоснование дифференцированной коррекции лейкопений при миелосупрессиях (27.01.2012)

Автор: Мирошниченко Лариса Аркадьевна

4. Патогенетически обосновать дифференцированное применение гемостимуляторов в зависимости от механизмов, лежащих в основе изменений, развивающихся в кроветворной ткани при применении различных цитостатических препаратов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Основной причиной различных темпов и характера восстановления подавленного цитостатическими агентами гранулоцитарного ростка кроветворения при введении пантогематогена, глицирама, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) и D-глюкуроновой кислоты является неодинаковая чувствительность кроветворных элементов грануломоноцитопоэза и гемопоэзиндуцирующего микроокружения к действию цитостатиков и гемостимуляторов.

2. Более выраженный стимулирующий эффект изучаемых препаратов в отношении кроветворения, подавленного алкилирующим агентом, связан с менее токсичным действием циклофосфана на клеточные элементы кроветворного микроокружения по сравнению с антиметаболитом 5-фторурацилом.

3. В основе активирующего действия пантогематогена и глицирама на костномозговой гранулоцитопоэз в условиях цитостатических миелосупрессий лежит стимуляция продукции гуморальных регуляторов кроветворения клетками ГИМ и нормализация структурно-функциональной организации костного мозга. Вместе с тем, ускорение процессов регенерации кроветворной ткани под действием Г-КСФ и D-глюкуроновой кислоты при назначении антибластомных препаратов связано с непосредственным влиянием на функциональную активность пула коммитированных прекурсоров.

4. В условиях введения алкилирующего агента наиболее предпочтительными корректорами нарушений, возникающих со стороны гранулоцитарного ростка, являются Г-КСФ и D-глюкуроновая кислота, в случае назначения фторпиримидинового антиметаболита значительная стимуляция подавленного гранулоцитопоэза наблюдается под влиянием пантогематогена и глицирама.

Научная новизна. В работе впервые расшифрован ряд тонких, специфичных для каждого из гемостимуляторов (пантогематоген, глицирам, Г-КСФ и D-глюкуроновая кислота) механизмов активации гранулоцитарного ростка кроветворения при цитостатических миелосупрессиях. При этом прослежен различный уровень изменений показателей, характеризующих механизмы регуляции гранулоцитопоэза, в ответ на введение исследуемых препаратов на фоне различных по механизму действия цитостатиков (циклофосфан, 5-фторурацил).

Гемостимулирующий эффект пантогематогена обусловлен возрастанием функциональной активности стромальных элементов ГИМ и накоплением в кроветворной ткани прекурсоров грануломоноцитопоэза. В основе активации регенерации гранулоцитарного ростка кроветворения глицирамом лежит ускорение процессов дифференцировки (в условиях введения циклофосфана) либо пролиферации (на фоне 5-фторурацила) прекурсоров грануломоноцитопоэза вследствие повышения уровня гуморальных регуляторов кроветворения (КСА от адгезирующих миелокариоцитов).

Гемостимулирующая активность Г-КСФ и D-глюкуроновой кислоты связана с непосредственным их эффектом в отношении кроветворных клеток-предшественников, а именно, повышением их функциональной активности. Г-КСФ ускорял выход гранулоцитомакрофагальных прекурсоров в дифференцировку либо увеличивал их пролиферативную активность, в том числе, благодаря повышению секреторной активности неприлипающих миелокариоцитов. D-глюкуроновая кислота в условиях введения циклофосфана ускоряла дифференцировку гранулоцитомакрофагальных клеток-предшественников за счет быстрой нормализации структурно-функциональной организации костного мозга. При миелосупрессии, вызванной 5-фторурацилом, D-глюкуроновая кислота способствовала активации деления прекурсоров грануломоноцитопоэза, что связано с увеличением концентрации гуморальных регуляторов гемопоэза в сыворотке крови.

Впервые дана интегральная оценка гемостимулирующему эффекту исследуемых препаратов (пантогематоген, глицирам, Г-КСФ и D-глюкуроновая кислота) в отношении гранулоцитопоэза, подавленного циклофосфаном либо 5-фторурацилом, с определением корреляционных взаимосвязей параметров.

Патогенетически обоснована эффективность применения Г-КСФ и D-глюкуроновой кислоты при моделировании цитостатической болезни алкилирующим агентом, пантогематогена и глицирама – в условиях введения фторпиримидинового антиметаболита.

В работе впервые в сравнительном аспекте изучен гемостимулирующий эффект пантогематогена, глицирама, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и D-глюкуроновой кислоты при миелосупрессиях, вызванных различными цитостатическими препаратами. Установлено, что выраженность эффектов гемостимуляторов на модели цитостатической миелосупрессии, вызванной фторпиримидиновым антиметаболитом, в значительной степени уступает таковой при назначении циклофосфана, что связано с более глубокими деструктивными изменениями клеточных элементов гемопоэзиндуцирующего микроокружения, вызванными антиметаболитом.

Практическое значение работы. Исследования, выполненные на моделях цитостатических миелосупрессий, обусловленных введением различных по механизмам действия препаратов, позволили разработать патогенетически обоснованные методы коррекции лейкопений, вызванных противоопухолевыми агентами. Детальное изучение механизмов регуляции кроветворения и действия на гемопоэз биологически активных веществ различной природы позволило предложить методологию применения гемостимуляторов для лечения лейкопений различного генеза.

Изданы «Методические указания по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ» (МЗ РФ, Москва, 2002).

В настоящее время разрешены к клиническому применению и производству Министерством Здравоохранения Российской Федерации пантогематоген сухой (ОАО «Синтез», Курган), нейтростим (ГНЦ ВБ «Вектор», Новосибирск), глицирам (ООО ФК «Здоровье», Харьков).

Получены патенты: РФ № 2088249 от 27.08.1997 г. на изобретение “Гемостимулятор”, РФ № 2182007 от 10.06.2002 г. на “Средство, стимулирующее грануломоноцитопоэз при гипопластических состояниях кроветворения”, РФ № 2270022 от 20.02.2006 г. на “Способ получения кондиционной среды, обладающей колониестимулирующей активностью”, РФ № 2332667 от 27.08.2008 г. на “Способ оценки гранулоцитопоэзстимулирующей активности фармакологических веществ”, РФ № 2399664 от 20.09.2010 г. на “Способ определения продукции факторов хоминга стволовых клеток”. Получена приоритетная справка по заявке № 2010141630 от 04.07.2011 г. “Способ стимуляции in vitro полипотентных гемопоэтических стволовых клеток”.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на VII, VIII, Х Российском национальном конгрессе “Человек и лекарство” (Москва, 2000, 2001, 2003), на I-м Международном симпозиуме по изучению и технологии производства продуктов пантового мараловодства (Канада, 2000), на 8-м минисимпозиуме по передовым научно-техническим технологиям (Япония, 2000), на конференциях молодых ученых СО РАМН “Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины” (Новосибирск, 2000), на II-й объединенной научной сессии СО РАН и СО РАМН (Новосибирск, 2002), на 2-м Съезде Российского Научного Общества фармакологов (Москва, 2003), на 3-й международной конференции «Клинические исследования лекарственных средств» (Москва, 2003), на конференциях молодых ученых «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2002, 2005), на конференциях молодых ученых «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2005, 2006), на конференции «Актуальные проблемы фармакологии», посвященной 20-летию ГУ НИИФ ТНЦ СО РАМН (Томск, 2004), на III Съезде физиологов Урала (Екатеринбург, 2006), на Российской конференции «Создание новых лекарственных препаратов» (Томск, 2007), на Российской конференции с международным участием «Фундаментальные вопросы гематологии. Достижения и перспективы» (Екатеринбург, 2010), на Всероссийской конференции «Фармакологическая регуляция стволовых клеток» (Томск, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 43 печатные работы, из них 23 – в центральных журналах, рекомендованных перечнем ВАК.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 353 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов, списка использованной литературы и приложения. Работа иллюстрирована 15 рисунками и 79 таблицами (таблицы 56-79 размещены в приложении). Библиографический указатель включает 678 источников, из них 293 отечественных и 385 иностранных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены на 1340 мышах-самцах линии СВА/CaLac в возрасте 2-2,5 месяцев массой 18-20 г. Животные 1 категории (конвенциональные линейные мыши) получены из питомника НИИ фармакологии СО РАМН (сертификат имеется).

Циклофосфан (ЦФ) (“Биохимик”, Саранск), 5-фторурацил (5-ФУ) (Украина, химфармобъединение «Дарница») вводили внутрибрюшинно однократно в максимально переносимой дозе (МПД), составившей по результатам пробит-анализа соответственно 250 мг/кг и 228 мг/кг. Начиная со следующего дня после введения цитостатика мыши опытных групп получали официнальные лекарственные препараты: пантогематоген сухой (ПГ) (ОАО «Синтез», Курган) per os семикратно по 50 мг/кг 1 раз в сут ежедневно; глицирам (ООО ФК «Здоровье», Харьков) per os пятикратно по 50 мг/кг 1 раз в сут ежедневно; препарат гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) (ГНЦ ВБ «Вектор», Новосибирск) подкожно в дозе 125 мкг/кг ежедневно в течение 5-ти дней; препарат D-глюкуроновой кислоты (ГНЦЛС, Харьков) внутривенно трехкратно в дозе 50 мг/кг на 3-и,4-е и 5-е сут после введения цитостатика.

Контрольным животным во всех сериях экспериментов в аналогичных условиях вводили эквивалентный объем физиологического раствора. Фоновые показатели получали при обследовании интактных животных. Мышей умерщвляли на 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14-е и 16-е сут после введения цитостатика путем ингаляции СО2.

Показатели периферической крови и костномозгового кроветворения определяли общепринятыми гематологическими методами [Гольдберг Е.Д. и др., 1992]. Содержание коммитированных клеток-предшественников грануломоноцитопоэза (КОЕ-ГМ, КлОЕ-ГМ) и эритропоэза (КОЕ-Э, КлОЕ-Э) в костном мозге изучали in vitro методом клонирования миелокариоцитов в полувязкой культуральной среде. Интенсивность созревания гранулоцито-макрофагальных и эритроидных прекурсоров определяли по величине индекса созревания (отношение числа кластеров к количеству колоний, выросших в той же лунке). Исследование пролиферативной активности предшественников грануломоноцито- и эритропоэза производили с помощью метода “клеточного самоубийства” путем поглощения гидроксимочевины в культуре ткани. Структурно-функциональную организацию костного мозга исследовали путем ферментативного выделения гемопоэтических островков (ГО) и последующей оценки их количественного и качественного состава. Колониестимулирующую (КСА) и эритропоэтическую (ЭПА) активности тестировали микрометодом в 96-луночных планшетах. КСА и ЭПА выражали количеством выросших гранулоцито-макрофагальных и эритроидных колоний (на 105 интактных миелокариоцитов) [Гольдберг Е.Д. и др., 1992]. Изучение прямого действия препаратов на эффективность клонирования in vitro КОЕ-ГМ и КОЕ-Э из костного мозга интактных мышей осуществляли в метилцеллюлозной среде. Статистическую обработку полученных результатов проводили методами вариационной статистики. В случаях нормального распределения признаков для статистической оценки применяли параметрический t-критерий Стьюдента [Урбах В.Ю., 1975]. При больших отклонениях распределений признака от нормального вида для независимых выборок использовали непараматрический критерий Уилкоксона-Манна-Уитни [Урбах В.Ю., 1975]. Для оценки степени связи между признаками использовался двумерный корреляционный анализ [Лакин Г.Ф., 1990; Мендрина Г.И. и др., 2004]. Оценка влияния препаратов на показатели гранулоцитопоэза проводилась с помощью интегральных показателей [Новицкий В.В. и др., 1990].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенные исследования показали, что однократное введение ЦФ мышам линии СВА/CaLac в МПД приводит к развитию гипоплазии костномозгового кроветворения. При этом имело место подавление практически всех ростков гемопоэза. Депрессия костномозгового кроветворения сопровождалась соответствующими изменениями в динамике содержания зрелых элементов изучаемых ростков в периферической крови.

Изучение механизмов постцитостатической регенерации гранулоцитопоэза показало, что восстановление миелопоэза после введения алкилирующего агента на ранних этапах обусловлено активацией созревания гемопоэтических предшественников в более зрелые элементы. При этом компенсаторные процессы в костномозговой ткани связаны с возрастанием секреторной активности прилипающих миелокариоцитов с 3-х по 12-е сут эксперимента. На это указывают вновь возникшие корреляты между динамикой накопления предшественников грануломоноцитопоэза и продукцией КСА клетками прилипающей фракции костномозговых нуклеаров (r=0,807) (рис. 1).

У мышей, получавших 5-ФУ, была обнаружена более глубокая и продолжительная ингибиция костномозгового кроветворения, чем в случае назначения ЦФ. Активация процессов регенерации гранулоцитарного ростка при моделировании гемодепрессии 5-ФУ наступает значительно позже (с 14-х сут), чем при введении ЦФ (с 5-х сут). При изучении механизмов повреждающего действия антиметаболита на кроветворную ткань было выявлено, что поздняя активация гранулоцитарного ростка при моделировании миелосупрессии 5-ФУ связана с нарушением нормального течения процессов созревания прекурсоров в ранние сроки (с 3-х по 6-е сут) и снижением продукции колониестимулирующей активности адгезирующими элементами микроокружения практически на протяжении всего периода наблюдения.

В настоящее время считается доказанным существование единой системы регуляции жизнедеятельности кроветворной ткани, включающей взаимосвязанные локальные (микроокружение) и дистантные (нейроэндокринные) контролирующие механизмы, направленные на обеспечение необходимого числа специализированных клеток крови как в физиологических условиях, так и в ответ на действие чрезвычайных раздражителей [Гольдберг Е.Д. и др., 1996, 1997]. Как известно, стрессреализующие гормоны, выделяющиеся в кровь при цитостатическом воздействии, осуществляют как прямое, так и опосредованное через элементы кроветворного микроокружения влияние на гемопоэтические клетки [Балицкий К.П., Шмалько Ю.П., 1987; Дыгай А.М., Клименко Н.А., 1992; Гольдберг Е.Д. и др., 1999].

Чтобы исключить участие дальноранговых механизмов регуляции системы крови в процессах постцитостатической репарации, было проведено исследование прямого влияния цитостатиков на функциональную активность клеток различных фракций костного мозга in vitro. При этом удалось установить, что добавление непосредственно в культуру клеток костного мозга ЦФ стимулировало способность адгезирующих миелокариоцитов поддерживать рост гемопоэтических колоний in vitro. В то же время, обработка прилипающих костномозговых элементов 5-ФУ существенно угнетала фидерную активность указанных клеток в отношении интактных гранулоцитарно-макрофагальных и эритроидных прекурсоров. Преинкубация неприлипающих клеток костного мозга с цитостатическими препаратами не поддерживала рост КОЕ-Э и не влияла на выход гранулоцитарно-макрофагальных колоний из интактных миелокариоцитов при их совместном культивировании.

Результаты опытов, проведенных с цитостатиками in vitro, убедительно подтверждают полученные в других экспериментах данные о токсическом влиянии антиметаболита на функциональную активность фибробластов, моноцитов и макрофагов, и значительно менее выраженном в указанном отношении эффекте алкилирующего агента. Причины таких различий заключаются, по-видимому, в особенностях физиологии указанных клеток (высокая секреторная активность и низкий темп пролиферации) в совокупности с механизмом действия конкретного препарата [Гольдберг Е.Д. и др., 1999].

Подводя итог изложенному, можно заключить, что характер течения восстановительных процессов в кроветворной ткани после цитостатического воздействия определяется не только непосредственным влиянием противоопухолевых препаратов на гемопоэтические клетки, но и их действием на элементы кроветворного микроокружения. Причем течение процессов регенерации в костном мозге во многом определяется структурно-функциональным состоянием ГИМ: его организацией и секреторной активностью. Следовательно, различия в динамике восстановления кроветворения после применения 5-ФУ и ЦФ во многом обусловлены именно неодинаковым влиянием данных цитостатиков на функцию элементов ГИМ.

Дальнейшим шагом в нашем исследовании явилось проведение экспериментов, направленных на сравнительное изучение гранулоцитопоэзстимулирующей активности препарата животного происхождения (пантогематоген), препаратов на основе производных гликозаминогликанов (глицирам, D-глюкуроновая кислота) и препарата рекомбинантного цитокина (Г-КСФ).

Выполненные эксперименты позволили установить, что активация процессов регенерации гранулоцитарного ростка кроветворения под действием ПГ, глицирама, Г-КСФ либо D-глюкуроновой кислоты в условиях гипоплазии костного мозга, вызванной введением ЦФ либо 5-ФУ, имеет различный характер.

Изучение эффектов оригинального препарата животного происхождения – ПГ на модели миелосупрессии, вызванной введением ЦФ, показало, что увеличение числа морфологически идентифицируемых форм нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге мышей опытной группы по сравнению с контролем наблюдалось только на 6-10-е сут эксперимента. Описанным изменениям в целом соответствовала и динамика содержания зрелых клеток в периферической крови животных. Максимальная разница по количеству сегментоядерных нейтрофильных лейкоцитов, моноцитов и циркулирующих лимфоцитов между группами была зафиксирована на 10-е сут. Число сегментоядерных нейтрофилов и моноцитов в периферической крови опытных животных было повышенным и на 6-е, 12-е сут эксперимента соответственно. При этом возрастанию клеточности гранулоцитарного ростка гемопоэза у мышей, получавших ПГ, предшествовало значительное увеличение числа прекурсоров грануломоноцитопоэза на 5-е сут опыта. В дальнейшем, на 10-е сут наблюдения содержание предшественников грануломоноцитопоэза в костном мозге мышей после применения гемостимулятора также превосходило описанное в контрольной группе. Как оказалось, указанные изменения были связаны с ускорением деления КОЕ-ГМ с 6-х сут по 12-е сут опыта. Стимуляция процессов дифференцировки отмечалась лишь на 10-е сут опыта.

Применение ПГ также приводило к быстрой репарации структурно-функциональной организации костного мозга. Увеличение числа клеточных ассоциаций, содержащих в своем составе стромальную клетку, и островков гранулоцитарного типа по сравнению с контрольной группой имело место, начиная с 6-х сут опыта и вплоть до окончания наблюдения. Наряду с этим, препарат усиливал секрецию КСА клетками прилипающей фракции микроокружения на 10-е и 12-е сут и повышал КСА сыворотки крови с 8-х по 12-е сут опыта. При этом ПГ не оказывал влияния на неприлипающие клетки ГИМ. Увеличение интегрального показателя (в 2 раза) для отделов морфологически распознаваемых клеток, а также для гемопоэтических прекурсоров в группе мышей, леченных ПГ, подтверждает влияние исследуемого препарата на динамику вышеперечисленных показателей (табл. 1). В структуре корреляционных связей прослеживалась организация дополнительных причинно-следственных связей между формированием гранулоцитарных ГО и количеством незрелых нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге после сочетанного введения ЦФ и ПГ (рис. 1).

Таким образом, можно констатировать, что в основе активирующего влияния пантогематогена на кроветворение лежит возрастание функциональной активности стромальных элементов ГИМ и стимуляция процессов пролиферации клеток - предшественников гемопоэза. Об этом свидетельствует значительное возрастание интегрального показателя (ИП) для гемопоэтинов, продуцируемых прилипающими миелокариоцитами, а также для КОЕ-ГМ в S-фазе митотического цикла (табл. 1). Кроме того после использования ПГ на фоне ЦФ наблюдалось появление прямой корреляции между уровнем КСА от адгезирующих миелокариоцитов и процессами пролиферации прекурсоров грануломоноцитопоэза (r=0,809). В пользу значения дистантных механизмов в реализации регуляторных влияний пантогематогена на гранулоцитопоэз свидетельствует высокая степень взаимосвязи «сегментоядерные нейтрофилы – КСА сыворотки», а локальных – «зрелые нейтрофильные гранулоциты – КСА от неадгезирующих миелокариоцитов» (рис. 1).

Следует отметить, что в основе активации данным препаратом гемопоэза может лежать и модуляция функции центральных нейроэндокринных механизмов регуляции кроветворения [Гольдберг Е.Д. и др., 1997; Грибов А.С., 2000; Суслов Н.И., 2004].

Проведенные эксперименты позволили установить, что препарат из солодки голой (глицирам) оказывает стимулирующее влияние на процессы восстановления костномозгового кроветворения, подавленного ЦФ, за счет повышения количества незрелых и зрелых нейтрофильных гранулоцитов, а также лимфоидных клеток с развитием гиперплазии костного мозга на 8, 10-е сут опыта. В то же время, глицирам вызывал развитие преходящей лейкопении (до 8-х сут) за счет уменьшения числа палочкоядерных форм лейкоцитов (6-е и 12-е сут) и циркулирующих лимфоцитов (6, 8-е сут). С другой стороны, введение исследуемого препарата приводило к увеличению числа моноцитарно-макрофагальных элементов в периферической крови мышей по сравнению с таковым в контроле (6, 8-е сут). Результатом описанных изменений явилось незначительное падение интегрального показателя для общего количества лейкоцитов, лимфоцитов на фоне его возрастания (незрелые и зрелые нейтрофильные гранулоциты, моноциты периферической крови) по сравнению с одним цитостатиком (табл. 1). В структуре корреляционных связей следует отметить отсутствие координации в отделе морфологически распознаваемых клеток по сравнению с циклофосфаном (рис. 1).

Изучение механизмов репарации кроветворной ткани под действием глицирама выявило постепенное накопление коммитированных клеток-предшественников после периода непродолжительной депрессии их числа. Так, на 10-е сут количество КОЕ-ГМ в 2,3 раза превышало таковое у мышей, получавших только цитостатик. При этом исследование пролиферативной активности гемопоэтических прекурсоров позволило обнаружить снижение доли предшественников в S-фазе митотического цикла практически на протяжении всего эксперимента по сравнению с контрольной группой. В то же время, имело место достоверное увеличение интенсивности созревания КОЕ-ГМ на 4-е и 10-е сут наблюдения при параллельном повышении содержания макрофагнегативных и гранулоцитарных ГО в костном мозге (4,5,8-е и 12-е сут). При этом после сочетанного применения глицирама и цитостатика в наибольшей степени возрастает ИП для клеточных ассоциаций, содержащих стромальную клетку, и коэффициента дифференцировки в 7 и 5 раз соответственно по сравнению с контрольной группой (табл. 1). Указанные изменения связаны с возрастанием продукции КСА адгезирующими клетками ГИМ в ранние сроки наблюдения (4-е сут) и неадгезирующими - на 6 сут, о чем свидетельствует увеличение числа корреляционных взаимоотношений в отделах гемопоэтинов и гемопоэтических прекурсоров (рис. 1).


загрузка...