Молекулярно-генетическое исследование аллергических заболеваний (27.01.2012)

Автор: Карунас Александра Станиславовна

В исследованной нами выборке с наиболее высоким уровнем значимости с развитием БА был ассоциирован ОНП rs7216389 (c.236-1199С>T), расположенный в первом интроне гена GSDMB (p=1,01x10-7). Частота встречаемости аллеля rs7216389*T у больных БА из РБ была выше (59,55%), чем в контрольной группе – 45,04% (p=1,01x10-7; OR=1,8 (CI95% 1,45-2,23)).

Рис.2. Графическое изображение результатов полногеномного анализа ассоциации 550 915 ОНП с бронхиальной астмой (Manhattan plot). На оси X указана хромосомная локализация ОНП, на оси Y - значения отрицательного десятичного логарифма уровня значимости P-value. Горизонтальная черта соответствует принятому в данной работе пороговому уровню значимости, при котором доля ожидаемых ложноположительных результатов равна 5%.

Гомозиготный генотип rs7216389*T/Т в группе пациентов определялся в 37,27% случаев, в контроле – в 21,87% (p=1,2x10-5, OR=2,12 (CI95% 1,51-2,98)).

Ассоциация БА с ОНП области 17q12-q21 наблюдалась с различной степенью выраженности и при анализе ассоциации, проведенном в отдельных этнических группах – у русских (p=2,15x10-5 для rs7216389 при сравнении частот аллелей у больных БА и в контрольной группе), татар (p=0,049 для rs7216389) и башкир (p=0,0043 для rs7216389). Анализ ассоциации ОНП области 17q12-q21 в подгруппах с детской астмой (возраст манифестации <18 лет) и БА с поздней манифестацией заболевания (>18 лет) показал наличие выраженных различий в распределении частот аллелей ОНП данной области между больными и контролем в обеих подгруппах. Наиболее высокий уровень ассоциации БА и в той, и в другой подгруппах установлен для ОНП rs7216389 (р=1,97х10-6 и р=1,8х10-4, соответственно). Анализ ассоциации ОНП области 17q12-q21 в группах больных с различной тяжестью течения БА выявил тенденцию увеличения частоты аллелей и генотипов повышенного риска по данным локусам от легкой до тяжелой степени течения БА.

.При анализе гаплотипов обнаружено, что маркером повышенного риска развития БА является наиболее распространенный гаплотип CGGGAGTT (р=2,77х10-7, OR=1,76 (CI95% 1,42-2,18)). Этот гаплотип по генотипированным локусам оказался идентичным гаплотипу, ассоциированному с повышенным уровнем экспрессии генов GSDMB и ORMDL3 в клеточных линиях лимфобластов индивидов европейского происхождения (CEU, HapMap) (Verlaan et al., 2009). Таким образом, при полногеномном исследовании установлена статистически значимая ассоциация полиморфных локусов, локализованных в области 17q12-21, и составленных по ним гаплотипов с развитием бронхиальной астмы у индивидов русской, татарской и башкирской этнической принадлежности.

Рис. 3. Структура неравновесия по сцеплению между ОНП, локализованными в области 17q12-q21 (Haploview 4.2). В верхней части рисунка показана локализация ОНП в генах IKZF3, ZPBP2, GSDMB (GSDML), ORMDL3. Черными линиями очерчены гаплотипические блоки. В ячейках указаны значения коэффициента неравновесия по сцеплению D`(в ячейках без указанных значений D`=1). Различные оттенки серого цвета отображают силу неравновесия по сцеплению между ОНП.

Репликация результатов анализа ассоциации БА

с полиморфными вариантами гена GSDMB

Для подтверждения ассоциации полиморфных локусов, локализованных в области 17q12-q21, с развитием БА в РБ, нами проведен анализ трех ОНП гена GSDMB (rs2305480, rs2290400, rs7216389), в независимой выборке больных БА (202 чел.) и в контрольной группе русской, татарской и башкирской этнической принадлежности (220 чел.). Частоты аллелей и генотипов ОНП rs7216389 в новой выборке больных БА и контроля оказались сходными с таковыми в первоначально исследованных группах. Аллель rs7216389*Т встречался с более высокой частотой у больных БА – 57,43% по сравнению с 47,95% в контроле (р=0,0059; OR=1,46 (CI95% 1,12-1,92)) Исследование ОНП rs2290400 также выявило наличие ассоциации данного локуса c БА (р=0,0047, ORT=1,48 (CI95% 1,13-1,94)). Анализ ассоциации гаплотипов по трем полиморфным вариантам гена гасдермина В с БА показал, что гаплотип GTT (rs2305480, rs2290400, rs7216389) является маркером повышенного риска развития БА (р=0,0028). Анализ ассоциации трех ОНП гена GSDMB, проведенный с учетом возраста манифестации заболевания, выявил различия в распределении частот аллелей всех трех локусов между больными детской БА и контрольной группой: rs2305480 (p=0,0451; ORT=1,37 (1,01-1,88)), rs2290400 (p=0,0021; ORT=1,62 (CI95% 1,19-2,21)), rs7216389 (р=0,0029; ORT=1,59 (1,17-2,18)). Гаплотип GTT (rs2305480, rs2290400, rs7216389) у больных детской БА встречался на 59,5% хромосом, в контроле – на 46,3% (р=0,0007). У больных с поздней манифестацией заболевания частоты аллелей и генотипов полиморфных локусов гена GSDMB статистически значимо не отличались от частот аллелей и генотипов данных локусов в контрольных группах (p>0,05). Учитывая, что в независимой выборке больных БА и индивидов контрольной группы не подтверждена ассоциация полиморфных вариантов гена GSDMB с развитием БА в возрасте >18 лет, можно сделать вывод о том, что ОНП области 17q12-q21, имеют более важное значение в развитии БА в детском возрасте. По данным литературы, в большинстве предыдущих исследований была показана ассоциация ОНП области 17q12-21 только с БА, дебютировавшей в детском возрасте (Moffatt et al., 2007, 2010; Bouzigon et al., 2008; Hirota et al., 2008; Tavendale et al., 2008; Bisgaard et al., 2009; Leung et al., 2009; Wu et al., 2009; Halapi et al., 2010; Smit et al., 2010; Binia et al., 2011; Yu et al., 2011).

Анализ ассоциации полиморфных локусов гена GSDMB с аллергическими заболеваниями

Анализ трех ОНП гена GSDMB (rs2305480, rs2290400, rs7216389) также проведен на расширенной выборке больных (906 человек) с различными клиническими проявлениями и сочетаниями АЗ (рис. 4).

Рис. 4. Результаты анализа ассоциации полиморфного варианта rs7216389 гена GSDMB с развитием аллергических заболеваний. На оси Х указана частота встречаемости аллеля rs7216389*Т.

В объединенной группе больных установлена ассоциация полиморфных вариантов гена GSDMB с развитием АЗ в целом: rs2305480 (р=0,00047; OR=1,37 (CI95% 1,15-1,64)), rs2290400 (p=5x10-5; OR=1,44 (CI95% 1,21-1,72)), rs7216389 (p=3,2x10-5; OR=1,45 (CI95% 1,22-1,73)). Кроме того, обнаружена ассоциация данных локусов с развитием БА в качестве единственного проявления аллергопатологии и БА в сочетании с другими аллергическими заболеваниями - с АР или с АР и АД. Ассоциация данных локусов с собственно БА и БА с сопутствующими АР и/или АД наблюдается у русских и башкир. У татар обнаружена ассоциация ОНП rs2305480, rs2290400, rs7216389 гена GSDMB с развитием сопутствующих БА и АР. Проведенный анализ гаплотипов трех полиморфных локусов гена GSDMB (rs2305480, rs2290400, rs7216389) подтвердил результаты ассоциаций отдельных полиморфных вариантов гена с различными клиническими проявлениями и сочетаниями аллергических заболеваний. Не выявлено ассоциации данных полиморфных локусов и составленных по ним гаплотипов с развитием АР и АД без клинических проявлений БА, что свидетельствует о значении данных локусов в развитии именно БА и о возможности использования их в качестве прогностических маркеров риска развития БА у больных АД и АР.

Ассоциация бронхиальной астмы с полиморфными локусами, локализованными в областях 9p13 и 7p12.3

В проведенном нами полногеномном анализе ассоциации было выявлено еще несколько полиморфных локусов, кроме локализованных в области 17q12-q21, ассоциированных с БА с высоким уровнем значимости порядка 10-6.

). Обе изоформы beta-1,4-GalT-I экспрессируются в моноцитарных дендритных клетках и CD4(+) T лимфоцитах человека и являются одними из ключевых молекул клеточной адгезии, участвующими во взаимодействии дендритных клеток с Т-лимфоцитами (Han et al., 2009; Cheng et al., 2010). Экспрессия длинной формы beta-1,4-GalT-I повышается под действием IL12 и IL4 в присутствии IL2, что свидетельствует о том, что данная форма белка может активно участвовать в дифференциации и функционировании Th1/Th2 клеток (Han et al., 2009).

При полногеномном анализе установлена также выраженная ассоциация БА с ОНП rs1496499 (g.45979023T>G), локализованным в области 7p12.3 (p=4,77x10-6). Аллель rs1496499*Т, обнаруженный на 55,78% хромосом больных и 43,29% хромосом здоровых индивидов, оказался маркером повышенного риска развития БА (p=4,77x10-6; OR=1,65 (CI95% 1,33-2,05)). Генотип rs1496499*Т/Т встречался у больных БА с частотой 30,09%, в контрольной группе - 20,12% (р=0,0028; OR=1,71 (CI95% 1,2-2,43)). Несколько ОНП, находящихся в сильном неравновесии по сцеплению с rs1496499, также показали выраженную ассоциацию с БА: rs2965072 (р=4,98х10-6), rs1534151 (р=2,18х10-5), rs2949833 (р=6,88х10-5), rs1534150 (р=6,13х10-5). Анализ ассоциации ОНП области 7p12.3 с учетом тяжести течения БА выявил наиболее выраженные различия между индивидами с тяжелым течением заболевания и контрольной группой. Ближайшим геном, расположенным на расстоянии около 18 т.п.н. от ОНП rs1496499, является ген IGFBP3, который кодирует белок 3, связывающий инсулиноподобные факторы роста IGF-I и IGF-II. ОНП rs3110697 (c.769-485T>C), расположенный в 3-ем интроне гена IGFBP3 и находящийся в тесном неравновесии по сцеплению с ОНП rs1496499, также показал наличие ассоциации с БА (р=0,0058). В ряде работ было выявлено, что инсулино-подобные факторы роста активируются при воспалении дыхательных путей и индуцируют пролиферацию и дифференциацию мезенхимальных клеток, стимулируя выработку коллагена, ангиогенез и гиперплазию гладкомышечных клеток – основных процессов, происходящих при ремоделировании легких (Pascual, Peters, 2005; Veraldi et al., 2009; Kaplan et al., 2011) .

Таким образом, впервые обнаружена ассоциация полиморфных локусов, локализованных в областях 9p13 и 7р12.3, с развитием и тяжестью течения БА, что свидетельствует о вероятной роли в развитии данного заболевания расположенных в данных хромосомных областях генов (B4GALT1 и IGFBP3), в развитии бронхиальной астмы.

Полногеномный анализ ассоциации бронхиальной астмы у индивидов различной этнической принадлежности

С целью выявления этноспецифических генетических факторов риска развития бронхиальной астмы проведен полногеномный анализ ассоциации в отдельных этнических группах - русских, татар и башкир.

У русских наиболее выраженные различия между больными БА и контрольной группой выявлены по полиморфным локусам гена муцина 19 (MUC19), локализованного в области 12q12. Ген MUC19 является одним из 24 генов, кодирующих у человека муцины, высокомолекулярные гликопротеины, являющиеся главной составной частью слизистого геля, покрывающего большинство эпителиальных поверхностей и служащего селективным барьером между клеточной мембраной и внешним окружением. MUC19 относится к подсемейству гель-формирующих муцинов, экспрессируется в основном в клетках подслизистых желез трахеи и слюнных желез (Desseyn et al., 2000; Chen et al., 2004). При некоторых заболеваниях MUC19 начинает экспрессироваться в эпителии – при аллергическом рините, хроническом среднем отите с эффузией (Kerschner, 2007; Ji, Guo, 2009; Zhu et al., 2010). Уровень продукции MUC19 регулируется цитокинами TNF-alpha, IL1b, IL6 и IL8, задействованными в аллергическом воспалении при БА (Kerschner et al., 2009).

В исследуемой нами выборке больных и контроля русской этнической принадлежности наиболее высокий уровень ассоциации БА обнаружен с ОНП rs2933346 (c.4048+292T>G), расположенным в 52 интроне гена MUC19. Частота аллеля rs2933346*G у больных БА была выше (85,25%), чем в контроле (68,53%) (р=2,59x10-6; OR=2,65 (CI95% 1,75-4,02)). Частота генотипа rs2933346*G/G у больных составляла 71,22%, в контрольной группе - 48,25% (p=8,5x10-5; OR=2,65 (CI95% 1,62-4,34)). Семь ОНП гена MUC19 (rs1492313 (p.Arg1524Lys), rs2588401 (p.Ala1734Thr), rs2588402 (p.Ala1770Thr), rs2638863 (p.Pro1785Thr), rs2638864 (p.Thr1878Ile), rs1352940 (c.16916-41G>A), rs2933373 (c.17123-477G>A)), пять из которых локализованы в центральном, 56-ом, экзоне гена и приводят к заменам аминокислот, были ассоциированы с БА с одинаковым уровнем значимости (р=4,96x10-6). Анализ неравновесия по сцеплению показал, что все они находятся в тесном неравновесии по сцеплению и входят в один гаплотипический блок размером около 29 т.п.н. Анализ гаплотипов 12 ОНП, входящих в данный блок, показал, что гаплотип GAAAATTAAGTA (rs2933346 - rs1492313 - rs2588401 - rs2588402 - rs2638863 - rs2638864 - rs2638880 - rs2920833 - rs1352940 - rs17597637 - rs719228 - rs2933373) является маркером повышенного риска развития БА у русских: его частота у больных составляла 68,8%, в контроле - 50,0% (р=4,96х10-6).

Таким образом, проведенный полногеномный анализ ассоциации показал наличие выраженной ассоциации БА у русских с ОНП, локализованными в гене муцина 19 (12q12). Ранее, по данным литературы, ассоциация БА и каких-либо других АЗ с данной областью и геном MUC19 не была выявлена ни в одной популяции. MUC19 является относительно недавно клонированным и просеквенированным геном среди всех муцинов (Chen et al., 2004; Zhu et al., 2010), и результаты исследований по изучению его экспрессии, полиморфных вариантов весьма ограниченны. Однако, его структурное сходство с другими гель-продуцирующими муцинами, экспрессирующимся в респираторном тракте, и повышенная экспрессия этого гена у больных АР дают возможность предположить, что MUC19 играет важную роль в развитии БА.

Полногеномный анализ ассоциации БА, выполненный у индивидов татарской этнической принадлежности, показал наличие наиболее статистически значимой ассоциации с ОНП rs12719740 (g.99072905G>A), расположенным в области 15q26.3 (p=4,65х10-7). В данном участке хромосомы локализовано два гена: FAM169B и IGF1R. Ген FAM169B принадлежит к семейству генов FAM169, кодирующих белки с неисследованной функцией. Ген рецептора инсулиноподобного фактора роста IGF1R экспрессируется практически во всех тканях. Рецептор IGF1R взаимодействует с высокой аффинностью с инсулиноподобным фактором роста 1 (IGF1) и инсулиноподобным фактором роста 2 (IGF2), с меньшей аффинностью – с инсулином (Le Roith et al, 1995). Как уже было сказано выше, инсулиноподобные факторы роста играют важную роль в процессах пролиферации, дифференциации, апоптоза клеток и ремоделирования дыхательных путей при хронических заболеваниях легких (Kaplan et al., 2011). При проведенном нами анализе распределения частот аллелей и генотипов ОНП rs12719740 установлено, что аллель rs12719740*G у больных БА встречается с более высокой частотой (90,34%), чем в контрольной группе (72,35%) (p=7,93x10-7; OR=3,57 (CI95% 2,12-6,03)). Частота гомозиготного генотипа rs12719740*G/G у больных БА составила 81,51%, в контрольной группе - 52,29% (р=2,5x10-6; OR=4,02 (CI95% 2,22-7,3)). Анализ неравновесия по сцеплению полиморфных локусов, локализованных в области 15q26.3, показал, что ОНП rs12719740 находится в одном гаплотипическом блоке, размером около 20 т.п.н., с 10 другими полиморфными локусами. У больных БА была выше частота встречаемости гаплотипа GACACGGCATC (rs8034376 - rs12914549 - rs4257189 - rs6598516 - rs12164914 - rs12719740 - rs8043332 - rs11247355 - rs933813 - rs933812 - rs4641724) (17,0% vs 9,2%) (?2=6,08; p=0,014). Таким образом, в результате проведенного исследования установлена ассоциация полиморфных локусов, локализованных в области 15q26.3, с развитием БА у татар. Учитывая, что ассоциированные локусы находятся в непосредственной близости к гену рецептора инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF1R), можно предположить, что данные ОНП играют роль в ремоделировании легких при бронхиальной астме.

У индивидов башкирской этнической принадлежности была обнаружена выраженная ассоциация БА с ОНП, локализованными в области 5q33. В хромосомной области 5q31-33 находится кластер генов цитокинов (IL4, 5, 9, 13, GM-CSF), участвующих в реакциях аллергического воспаления и ассоциированных с развитием АЗ по данным многочисленных исследований. Полиморфные локусы, ассоциированные с БА в настоящей работе, локализованы в гене GRIA1, кодирующем субъединицу AMPA – ионотропного рецептора глутамата. Субъединицы AMPA рецептора экспрессируются тканеспецифично, главным образом, в тканях переднего мозга и гиппокампа. В настоящее время в литературе активно обсуждается иммуномодуляторная роль глутаматных рецепторов: глутаматные рецепторы обнаружены на поверхности Т-лимфоцитов; установлено, что дендритные клетки секретируют глутамат, необходимый при взаимодействии Т-лимфоцитов и дендритных клеток (Pacheco et al., 2006). При полногеномном анализе обнаружена ассоциация ОНП в гене GRIA1 с аллергической реакцией на аспарагиназу у больных острой лимфобластной лейкемией (Chen et al., 2010).

Уровень значимости ассоциации ОНП с БА, выявленный в данном исследовании, достаточно широко варьировал при рассмотрении отдельных полиморфных вариантов гена GRIA1 (от р=0,0145 до р=4,25x10-7). С наиболее высоким уровнем значимости был ассоциирован ОНП rs9324750 (c.220+42404A>C), расположенный во втором интроне гена GRIA1. У больных БА частота аллеля rs9324750*А (36,96%) была значительно выше, чем в контрольной группе (12,78%) (p=4,25x10-7; OR=4,001 (CI95% 2,29-6,99)). Анализ неравновесия по сцеплению показал, что ОНП rs9324750 находится в тесном неравновесии по сцеплению с 7 ОНП, также локализованными во 2 интроне гена и входящими вместе с ним в один гаплотипический блок размером около 10 т.п.н. Гаплотип GTGCGGAT (rs495703 - rs480726 - rs726877 - rs726876 - rs1463747 - rs17114771 - rs9324750 - rs10041179) у больных БА встречался значительно чаще (в 24,6% случаев), чем в контрольной группе индивидов (9,4% случаев) (р=3,0x10-4). Таким образом, полногеномный анализ ассоциации БА у башкир выявил ассоциацию с ОНП в гене GRIA1, локализованном в области 5q33 и кодирующем субъединицу AMPA – ионотропного рецептора глутамата, предположительно играющего роль в инициации и регуляции T-клеточного иммунитета.

В целом, проведенное полногеномное исследование однонуклеотидных полиморфных вариантов у больных БА и индивидов контрольной группы показало наличие ассоциации БА с полногеномным уровнем значимости (p<4,79x10-7) с ОНП, локализованными в области 17q12-q21 (гены GSDMB и ORMDL3) и, по данным литературы, ассоциированными с развитием БА в популяциях различного этнического происхождения (табл. 4). Впервые обнаружена выраженная ассоциация БА с ОНП, локализованными в областях 9р13 (в гене B4GALT1) и 7р12.3 (в гене IGFBP3). Идентифицированы этноспецифические маркеры риска развития БА. У русских установлена значительная ассоциация БА с полиморфными вариантами гена муцина 19 (12q12). У татар с наиболее высоким уровнем значимости с БА были ассоциированы ОНП, расположенные в области 15q26.3, в которой локализован ген рецептора инсулиноподобного роста 1. У башкир выявлена значимая ассоциация с полиморфными вариантами гена GRIA1, локализованного в области 5q33 и кодирующего субъединицу AMPA – ионотропного рецептора глутамата.

Таблица 4

Маркеры повышенного риска развития бронхиальной астмы по результатам анализа генов-кандидатов и полногеномного анализа ассоциации

Русские Татары Башкиры Общая выборка

rs2243250*Т/Т

rs44707*А/А

rs7216389*T/T

B4GALT1

rs12342831*T/T

rs1496499*T/T

rs2933346*G/G NAT2

rs1799929*T/T

rs7216389*T/T

rs1496499*T/T


загрузка...