Адсорбция высокомолекулярных белков плазмы на эритроцитах и ее влияние на микрогемоциркуляцию (26.10.2009)

Автор: Смирнов Игорь Юрьевич

Непосредственное влияние мышечной нагрузки изучали, забирая кровь для анализа сразу после прекращения нагрузки. Тяжёлая нагрузка (продолжительность 70-90 минут) – 8 человек, субпредельная (150-180 минут) – 6 человек, с учётом повторных обследований 10 результатов.

Проведено обследование группы спортсменов через 16 – 18 часов после мышечной нагрузки. В группу после тяжёлой нагрузки вошло 7 человек и для анализа использованы результаты 21 обследования. После субпредельной нагрузки обследовано 6 человек и 10 результатов их обследования.

Во всех случаях кровь для анализа брали из локтевой вены в объёме 25 мл. В качестве антикоагулянта для 20 мл использовали гепарин. Для определения содержания фибриногена 5 мл крови стабилизировали 3,8% цитратом натрия.

1. Методы клинической оценки параметров крови

Традиционными клиническими методами определяли количество эритроцитов на микролитр (в камере Горяева), концентрацию гемоглобина в крови (цианметгемоглобиновым методом), показатель объёма фракции эритоцитов и лейкоцитов (центрифугированием в 100 мм капилляре), скорость оседания эритроцитов. Использовали группу расчётных параметров – среднее содержание и средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах, средний объём эритроцитов.

Концентрацию белков плазмы измеряли рефрактометрически и по биуретовой реакции колориметрически.

Разделение белков на фракции выполняли электрофорезом на бумаге. Абсолютные концентрации отдельных фракций рассчитывали по данным общей концентрации белков и их процентным соотношениям. Концентрацию фибриногена определяли суховоздушным методом по Рутбергу.

Методы оценки реологических параметров крови, плазмы и суспензий эритроцитов.

Вискозиметрия крови, плазмы и концентрированных суспензий красных клеток крови проводилась на оригинальном капиллярном полуавтоматическом вискозиметре, разработанном на кафедре медико-биологических основ спорта ЯГПУ (Смирнов И.Ю. и соав., 1992, 1996, 1997) на основе принципа измерения, предложенного M. Litt et al. 1988.

Вязкость внутреннего содержимого эритроцитов оценивали по формуле (P.Ross and A.P.Minton 1977).

Индекс ригидности Тк рассчитывали на основании данных вискозиметрии крови и плазмы, и величины гематокритного показателя (Dintenfass L. 1977).

Предельное напряжение сдвига рассчитывали по формуле

(Morris C.L., et al. 1989).

3. Методики оценки осмотических влияний на эритроциты

Осмолярность плазмы рассчитывали по данным электропроводности плазмы, фосфатного буферного раствора с осмолярностью 300 мосм/кг и общей концентрации белков плазмы. (Смирнов И.Ю., Чирикова О.А. 2003).

Измерения осмотической резистентности эритроцитов проводили на двухканальном дифференциальном фотоэлектроколориметре при ступенчатом снижении осмолярности.

При анализе результатов эритроциты разделяли на 3 группы – низкостойкие (разрушающиеся при снижении осмолярности до 120 мосм/л), высокостойкие (выдерживающие снижение осмолярности ниже 97 мосм/л) и среднестойкие (гемолизирующиеся при осмолярности 120-97 мосм/л). Представленные границы 120 и 97 мосм/л выбраны нами на основании анализа распределения эритроцитов по осмотической стойкости в группе спортсменов в состоянии относительного покоя. В указанный диапазон входило 67% от общего числа гемолизированных эритроцитов (М±?).

4. Приготовление концентрированных суспензий эритроцитов

Концентрированные суспензии нативных клеток получали центрифугированием крови в течение 15 минут при 2700 об./мин (1000g в области дна пробирки), затем тщательно удаляли плазму. Сравнительно малая величина ускорения использовалась с целью минимизаций гравитационных воздействия на клеточные мембраны.

Для трехкратных отмывок эритроцитов применялся К+-Na+-фосфатный буферный раствор с осмолярностью 300 мосм/л (рН - 7,4). При первых двух отмывках время центрифугирования ( 5 минут, при третьей ( 15 минут.

При ресуспендировании клетки, предварительно отмытые в фосфатном буферном растворе, инкубировали в исследуемой среде в течение 15 минут, затем центрифугировали 15 минут при 2700 об./мин.

Обработку эритроцитов протеолитическим ферментом выполняли при отмывках. Для второй отмывки использовали фосфатный буферный раствор с трипсином в концентрации 2 мг/мл. При третьей отмывке трипсин практически полностью удалялся.

5. Определение сиаловых кислот связанных с мембранными

белками

Для определения сиаловых кислот связанных с мембранными белками эритроцитов использовали кровь, стабилизированную цитратом натрия. Кровь центрифугировали в течение 15 мин. Полученную суспензию эритроцитов однократно отмывали фосфатно-буферным раствором. Затем 2мл клеток инкубировали 15 мин. в растворе трипсина, (10мг трипсина в 5мл фосфатного буферного раствора) и снова центрифугировали 15 мин.

Затем пипеткой отбирали 3мл надосадочной жидкости и смешивали с 2мл 7,5% раствора хлорной кислоты; тщательно перемешивали и помещали в водяную баню на 5 мин. После охлаждения центрифугировали 10 мин. для осаждения белков. К 4 мл полученного раствора добавляли 1мл реактива Эрлиха и снова помещали в водяную баню на 15 мин. После охлаждения измеряли оптическую плотность полученного раствора при длине волны фотоколориметра ( 540 нм.

6. Измерение импеданса крови, плазмы и концентрированных

суспензий эритроцитов.

При проведении измерений импеданса использовалась камера с электродами из медицинской нержавеющей стали. Электроды были выполнены в виде трубок, расположенных на краях цилиндрической ячейки. Величину постоянной камеры определяли по 0,1М раствору КСl.

Все измерения выполнены при температуре 37°С. Контроль температуры осуществлялся электронным регулятором с точностью ± 0.1°С.

Измерения импеданса на фиксированных частотах 1, 100, 300 кгц проводились на специально изготовленном измерителе импеданса, имеющем основную погрешность не более 1%. Ток, протекающий через камеру, был всегда одинаковым и составлял единицы нА, что определялось конструкцией преобразователя импеданс-напряжение.

7. Импедансная спектроскопия скелетной мышцы

Измерения проводили на мышцах голени с использованием 4-четырёх электродной системы. Расстояние между измерительными электродами составляло 100 мм. Электроды накладывали в области медиальной головки икроножной мышцы, предварительно тщательно обработав кожу спиртом. Между электродами и кожей для улучшения контакта помещали тонкий слой электропроводящего геля (Водолазский Л.А. 1966).

При измерении импеданса использовали частоты 5 и 500 кГц. В качестве измерителя применяли измеритель импеданса ИСГТ-1.

8. Лазерно-допплеровская флоуметрия

Использовался программно-аппаратный комплекс, состоящий из прибора ЛАКК-01, персонального компьютера и программы «Лакграф», разработанный в НПО «Лазма» (Россия) (Козлов В.И. 1997). Исследования проводили через 5 минут после адаптации пациента к условиям исследования при температуре 20(С в положении лёжа на спине.. Оценивали базальный кровоток, выражающийся в условных единицах (индекс микроциркуляции), и изменение кровотока под влиянием функциональных проб в процентах по отношению к исходной величине.

9.Ультразвуковое исследование скорости потока крови

в артериальных сосудах.

Ультразвукое исследование скорости движения крови в наружной сонной артерии проводили на аппарате «Sonos-100» (Hewlet Paccard). Исследование проводилось при горизонтальном положении пациента. Скорость движения крови измеряли располагая точки измерения; 1 - в центе сосуда (определяли визуально при максимальном диаметре сосуда на экране), 2 - в непосредственной близости от стенки сосуда в диаметрально противоположных точках и 3 - посередине между центральной и латеральными точками. Всего в 5 точках. Средняя скорость определялась по результатам измерений 5 сердечных циклов. На основании полученных данных строили профили скорости в систолу и диастолу.

10. Исследование состояния кровотока в микрососудах.


загрузка...