Проблемы лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis: ускоренное культуральное выявление, контроль адекватности химиотерапии,  вирулентность (26.10.2009)

Автор: Маничева Ольга Алексеевна

Маничева Ольга Алексеевна

ПРОБЛЕМЫ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ

MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS:

УСКОРЕННОЕ КУЛЬТУРАЛЬНОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ, КОНТРОЛЬ АДЕКВАТНОСТИ ХИМИОТЕРАПИИ, ВИРУЛЕНТНОСТЬ

03.00.07. – микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Санкт-Петербург

Диссертация выполнена в Федеральном Государственном учреждении "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии Федерального агентства высоких медицинских технологий"

Научный консультант доктор медицинских наук, профессор

Вишневский Борис Израилевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Кокряков Владимир Николаевич

доктор биологических наук, профессор

Заикина Надежда Александровна

доктор медицинских наук

Кафтырева Лидия Алексеевна

Ведущее учреждение: ГУ Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза РАМН

Защита диссертации состоится "___"___________2009 г. в _______часов на заседании диссертационного совета ДМ 001.022.01 при Учреждении РАМН Научно-исследовательскbq институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН (197376 Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИЭМ СЗО РАМН

Автореферат разослан "___"____________2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук Бурова Л.А.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Mycobacterium tuberculosis продолжает оставаться "успешным" патогеном и в XXI веке, так как, несмотря на достижения медицины, проблема туберкулеза остается актуальной для большинства стран. Высокую адаптивную способность вида Mycobacterium tuberculosis доказывает и очень быстрое его приспособление к новым условиям в эру применения антибактериальных препаратов - селекция и распространение лекарственноустойчивых штаммов. Наблюдающийся в последние годы подъем лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза, а также утяжеление ее структуры за счет роста множественной лекарственной устойчивости (Вишневский Б.И. и др., 1997; Вишневский Б.И., Вишневская Е.Б., 2003; Дорожкова И.Р.и др., 2000; Хоменко А.Г., Голышевская В.И., 1999; Goldman R.C., et al., 2007; Dye C., 2000; Su W.J., et al., 2008) значительно усложняет задачу лечения туберкулеза. Химиотерапия остается основным методом лечения больных туберкулезом, который обеспечивает прекращение бактериовыделения и прерывает распространение возбудителя. Широкое распространение в последние годы штаммов M.tuberculosis, принадлежащих к семейству Beijing, которое часто ассоциировано с высокой трансмиссивностью, множественной лекарственной устойчивостью и более тяжелыми и распространенными формами туберкулезного процесса (Кондакова М.Н., 2005; Нарвская О.В., 2003; Сапожникова Н.В., 2003; Drobniewski F., et al., 2005; Park Y.K., et al., 2005), еще более актуализирует задачу быстрого выявления наиболее эпидемиологически опасных M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью. В этих условиях возрастает роль бактериологических лабораторных методов определения резистентности M.tuberculosis и контроля адекватности химиотерапии.

Сегодня как никогда раньше, клиницисты заинтересованы в получении результатов определения лекарственной устойчивости в кратчайшие сроки. Учет результатов определения резистентности M.tuberculosis к противотуберкулезным препаратам стандартным методом абсолютных концентраций на плотной яичной среде Левенштейна-Йенсена производится на 21 сутки после посева культуры. На жидких средах микобактерии растут быстрее, но есть проблема визуализации их роста. В настоящее время для быстрого определения лекарственной устойчивости разработаны и используются системы бульонного культивирования, основанные на радиометрической, манометрической, колориметрической или флуоресцентной индикации роста M.tuberculosis в жидких средах – BACTEC 460, MB-BACT, BBL-MGIT, BACTEC MGIT 960, Versa Trek System (Иртуганова О.А. и др., 2000, 2001, а, б.; Palomino J.C.et al., 1999; Siddiqi S.H., et al., 1981; Zwolska Z., et al., 1999). С помощью этих систем спектр устойчивости может быть определен на 3-16 сутки прямым или непрямым методом. Молекулярно-генетические методы позволяют определить устойчивость к рифампицину, изониазиду, стрептомицину, этамбутолу, пиразинамиду по наличию мутаций в ДНК микобактерий, по сути, в день поступления патологического материала Но перечисленные выше методы требуют дорогостоящего аппаратурного оснащения и значительного финансирования и потому доступны лишь большим централизованным референс-лабораториям. Кроме того, наличие мутаций в генах не всегда проявляется фенотипически и на сегодняшний день выявлены не все мутации (Грядунов Д.А. и др., 2001; Литвинов В.И., 2001; Скрягина Е.М. и др., 2001; Bergval I.L., et al., 2007; Cardoso R.F., et al., 2007; Sekiguchi J., et al., 2007). Существующие фенотипические микрометоды определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis на основе жидких сред небезопасны, требуют дополнительного оснащения реактивами, расходными материалами, оборудованием (Caviedes L. et al., 2002; Collins L.A., Franzblau S.G., 1997; Banfi E., et al., 2003). В связи с этим чрезвычайно актуальной проблемой является разработка дешевых, безопасных, простых и доступных для лабораторий любого уровня методов ускоренного определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis и бактериостатической активности крови (БАК), или туберкулостатической пробы, так как это позволит клиницистам в короткие сроки выработать оптимальную тактику химиотерапии туберкулеза в зависимости от свойств возбудителя.

Широкое распространении штаммов генотипа Beijing, для которых характерна высокая частота поли- и мультирезистнтности (Нарвская О.В., 2003; Drobniewski F., et al., 2005; Park Y.K., et al., 2005), поднимает вопрос о соотношении лекарственной устойчивости и вирулентности M. tuberculosis тем более, что эта проблема до сих пор остается дискуссионной. Сложность изучения факторов вирулентности M.tuberculosis, обусловлена, в частности, тем, что экспрессия генов, кодирующих эти факторы, происходит только в адекватных условиях внутренней среды макроорганизма-хозяина, а рост бактерий на искусственных питательных средах в отсутствие атак иммунной системы не требует реализации действия этих генов (Сидоренко С.В., 1999; Caviedes L. et al., 2002; Srivastava V., et al., 2007). Кроме того, изучение факторов вирулентности в основном проводится при сравнении вирулентных и авирулентных (лабораторных или мутантных, полученных с помощью делеции генов) штаммов, сильно отличающихся друг от друга по степени патогенности. Все клинические изоляты безусловно вирулентны, коль скоро вызвали болезнь, однако, различия между штаммами, принадлежащими к генетическим кластерам разных объемов, могут быть менее отчетливы. В связи с этим актуальной является проблема адекватной оценки вирулентности M.tuberculosis разных генотипов. Существующие методы исследования вирулентности M.tuberculosis на различных моделях с использованием животных или молекулярно-генетических методов и их комбинаций очень дороги, длительны, доступны очень немногим лабораториям, оснащенным высокотехнологичным оборудованием, и не позволяют провести исследование достаточно большого числа штаммов различных генотипов с целью их сравнительной оценки. Использование тканевой культуры макрофагоподобных клеток человека в качестве модели для изучения одного из свойств вирулентности M.tuberculosis – способности вызывать некроз макрофагов (цитотоксичности), помогает решить проблему в трех планах. Во-первых, исследовать достаточно большое число клинических штаммов, во-вторых, уменьшить влияние видовой и индивидуальной генетической гетерогенности, которое весьма существенно влияет на оценку вирулентности при использовании животных и макрофагов ex vivo, и, в-третьих, количественно оценить, образно говоря в "чистом виде", вирулентность клинических штаммов M.tuberculosis различных генотипов и ее связь (или ее отсутствие) с лекарственной устойчивостью. Оценить пригодность такого метода для поставленной цели представляется возможным при сравнительном исследовании вирулентности M.tuberculosis генотипов Beijing и иных генотипов.

Цель работы: обосновать применение ускоренных методов определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis и бактериостатической активности крови для лабораторного контроля адекватности терапии, изучить вирулентность (цитотоксичность) M.tuberculosis в зависимости от генотипа и лекарственной устойчивости возбудителя.

Задачи исследования:

Исследовать возможность определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis посредством биохимической индикации метаболической активности микобактерий.

Разработать питательную среду для ускоренного определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis. Провести сравнительное исследование лекарственной устойчивости клинических штаммов M.tuberculosis с помощью ускоренного и стандартного методов.

Исследовать бактериостатическую активность крови больных туберкулезом органов дыхания с помощью стандартных методов, используя выделенные аутоштаммы M.tuberculosis, сопоставить полученные результаты с устойчивостью M.tuberculosis к противотуберкулезным препаратам и течением туберкулезного процесса. Дать оценку туберкулостатической пробе как методу бактериологического контроля адекватности химиотерапии.

Разработать ускоренный метод определения бактериостатической активности крови с помощью полужидкой питательной среды. Исследовать бактериостатическую активность крови больных туберкулезом органов дыхания с помощью ускоренного метода, сопоставить полученные результаты с клиническими и бактериологическими данными.

Исследовать вирулентность клинических штаммов M.tuberculosis по их способности активировать гибель макрофагов (цитотоксические свойства), сопоставить уровень вирулентности с генотипом и устойчивостью возбудителя.

Научная новизна

Впервые разработана полужидкая питательная среда, позволяющая получить визуально наблюдаемый рост культуры M.tuberculosis на 3-5 сутки после инокуляции суспензии. Разработанный ускоренный метод определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis к изониазиду, стрептомицину, рифампицину дает возможность иметь данные об устойчивости культуры к этим препаратам на 3-5-е сутки, о чувствительности – на 7-е после посева суспензии штамма M.tuberculosis. Предложенный метод позволяет на 2 недели раньше в сравнении со стандартным методом на плотной яичной среде Левенштейна-Йенсена изменить терапию, что особенно важно в связи со значительным увеличением множественной лекарственной устойчивости.

Впервые методом вертикальной диффузии показана четкая зависимость величины бактериостатической активности крови от устойчивости клинического изолята к изониазиду. С помощью разработанного ускоренного метода сопоставлены результаты определения туберкулостатической пробы как лабораторного метода контроля адекватности терапии и течения процесса у больных туберкулезом органов дыхания, и выявлена корреляция степени бактериостатическая активность крови и эффективности химиотерапии.


загрузка...