Роль цитомегаловирусной инфекции в патологии плода и новорожденного. Поиск новых противовирусных средств (26.10.2009)

Автор: Адиева Айна Ахмедовна

ИФА – иммуноферментный анализ

ИФН – интерферон

МИ – множественность инфицирования

МКА – моноклональные антитела

ОАГА – осложненный акушерско-гинекологический анамнез

ПСА – поликлональные антитела

ПЦР – полимеразная цепная реакция

ПЦР – IS - полимеразная цепная реакция in situ

ПЦР – RT - полимеразная цепная реакция с детекцией в реальном времени

РИФ (РНИФ) – реакция прямой (непрямой) иммунофлюоресценции

УФ - ультрафиолет

ФЛЭЧ – фибробласты легкого эмбриона человека

ХТИ – химиотерапевтический индекс

ЦД – цитотоксическая доза

ЦМВ – цитомегаловирус человека

ЦМВИ – цитомегаловирусная инфекция

ЦНС – центральная нервная система

ЦПД – цитопатическое действие

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Внутриутробная инфекция (ВУИ) занимает одно из ведущих мест в структуре перинатальной смертности, являясь основной причиной смерти или осложняя течение основного заболевания у 37,5% умерших новорожденных [Цинзерлинг и др., 2002]. Достоверных данных об истинной распространенности ВУИ нет, однако согласно данным ряда исследователей, инфекционные заболевания выявляют у 50-60% госпитализированных доношенных и 70% недоношенных новорожденных [Володин и др., 2004; Сидорова и др., 2006].

Цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ) является одной из наиболее распространенных внутриутробных инфекций, вызывающих тяжелые патологии, вплоть до гибели ребенка [Gibson et.al., 2008; Kenneson et.al., 2007; Kriebs et.al., 2008].

Прогресс в изучении ЦМВИ связан с разработкой и широким внедрением в практику здравоохранения принципиально новых диагностических технологий – высокочувствительных и специфичных методов иммунохимии, молекулярной и клеточной биологии. В связи с этим оценка эффективности современной специфической диагностики ЦМВИ приобретает особую актуальность.

Трудности анте - и постнатальной диагностики ЦМВИ связаны с неоднозначностью возможной реализации инфекционного процесса из-за особенностей иммунной системы новорожденных и неспецифичностью клинических проявлений. Несмотря на многочисленные исследования, посвященные этой проблеме, устоявшихся канонов пренатальной диагностики ЦМВИ в мире не существует. Разработка четких и общепринятых рекомендаций по лабораторному обследованию недоношенных новорожденных с сочетанной перинатальной патологией с подозрением на ЦМВИ и в России остается нерешенной задачей. Высокая инфицированность недоношенных новорожденных детей ЦМВ ставит вопрос о своевременной диагностике ЦМВИ у беременных женщин и о вертикальной передаче вируса. В связи с этим тактика ведения беременных женщин с высоким риском инфицирования плода должна включать эффективную диагностику и своевременное начало лечения ЦМВИ.

На клеточном уровне цитопатический эффект ЦМВ проявляется в изменении морфологии клетки и ядра (увеличение размера, изменение формы), в образовании многоядерных клеток и в появлении внутриядерных включений [Mocarski et.al., 2001]. В связи с этим, исследования, направленные на анализ действия ЦМВ на клеточную пролиферацию, вызывают особый интерес. Так, группой авторов было показано, что ЦМВ стимулирует репликацию клеточной ДНК в зараженных клетках [Hume et.al., 2008; Kalejta et.al., 2003; McElroy et.al, 2000; Prichard et.al., 2008], описывалось существенное возрастание митотического индекса в инфицированной культуре [Sanchez et.al., 2003; Tran et.al., 2008; Wiebusch et.al., 2005]. Позже появились работы, опровергающие эти данные. Было показано, что вирус может блокировать прохождение клеточного цикла клетками в нескольких точках, включая переход из G1 – периода в фазу синтеза ДНК [Lu and Shenk, 1999; Murphy et.al., 2000; Sinclar et.al., 2000] и переход из стадии G2 в М, в точке, обозначаемой как G2/М [Castillo et.al., 2005; Lu and Shenk, 1999; Sanchez et.al., 2006]. Таким образом, данные о влиянии ЦМВ на клеточную пролиферацию оказались противоречивыми и требовали дальнейшего исследования.

Фундаментальные данные о влиянии ЦМВ на клеточные структуры и жизненный цикл клетки необходимы для понимания процессов, приводящих к патологии при внутриутробном развитии детей и их гибели, а также для выбора адекватной терапевтической тактики новорожденных с ЦМВИ. Существующие на сегодняшний день единичные патентованные препараты, обладающие противовирусной активностью в отношении ЦМВ, не применяются у новорожденных и детей раннего возраста вследствие их высокой токсичности. Кроме того, эффективность лечения существующими препаратами снижена из-за развития лекарственной устойчивости, часто возникающей при длительном применении [Biron et.al., 2006; Chou et.al., 1999]. Поэтому поиск эффективных и нетоксичных анти-ЦМВ агентов, перспективных в качестве химиотерапевтических средств при ЦМВИ, остается важной проблемой. Все вышеизложенное в совокупности явилось обоснованием для проведения данного исследования.

Цель исследования.

Цель настоящей работы состояла в изучении маркеров ЦМВИ у недоношенных новорожденных детей с сочетанной перинатальной патологией в течение первого года жизни и в материалах аутопсии; мониторинга метаболической и иммунной терапии; в изучении антивирусной активности аминокислотных производных фуллерена С60; в исследовании действия ЦМВ жизненный цикл инфицированных клеток.

Для достижения поставленной цели ставились следующие задачи:

Выявить прямые (ДНК и инфекционная активность) и непрямые маркеры (специфические IgM, IgG и индекс авидности IgG антител) ЦМВИ у недоношенных новорожденных детей и изучить динамику их выявления в течение первого года жизни.

Установить возможность выявления инфекционно - активного ЦМВ с помощью быстрого культурального метода (БКМ) в материалах аутопсии плодов, умерших новорожденных и детей, умерших на первом году жизни.

Разработать метод ПЦР in situ для выявления ДНК ЦМВ на отпечатках различных органов. Оценить эффективность использования четырех методов лабораторной диагностики при детекции ЦМВ в материалах аутопсии.

Установить частоту выявления ЦМВ у беременных из группы высокого риска по перинатальному инфицированию плода и новорожденного. Оценить эффективность использования метаболических препаратов в предгравидарной подготовке и во время беременности.

Оценить эффективность использования Виферона у беременных с ОАГА со второго триместра беременности и у недоношенных детей с клиническими проявлениями ВУИ.

Изучить цитотоксичность и антивирусную активность аминокислотных производных фуллерена С60 (АПФ) на модели экспериментальной ЦМВИ in vitro. Сравнить эффективность указанных соединений при использовании лечебной, профилактической и вирулицидной схем воздействия. Оценить сочетанный эффект АПФ и Виферона и продукцию вируса под действием АПФ.

Изучить изменение пролиферативной активности в асинхронно - делящейся и синхронизированной культуре фибробластов легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ) под влиянием ЦМВ. Определить способность клеток ФЛЭЧ, инфицированных в разные периоды клеточного цикла, вступать в митоз.

Оценить развитие патологии митоза при инфицировании ЦМВ в присутствии ингибитора репликации вирусной ДНК и при инфицировании ЦМВ инактивированным УФ.

Научная новизна.

Впервые разработан и использован алгоритм комплексного обследования недоношенных новорожденных с клиническими признаками ВУИ вирусологическими методами (БКМ) и с помощью генодиагностики (ПЦР, ПЦР - real time) для выявления возбудителей герпесвирусных инфекций.

Впервые разработан метод ПЦР in situ для выявления ДНК ЦМВ на отпечатках и парафиновых срезах органов мертворожденных и детей, умерших на первом году жизни, который сочетает морфологический и молекулярный подходы и позволяет не только выявлять внутриклеточную вирусную ДНК в инфицированных клетках, но и оценить её сравнительное количество.


загрузка...