МЕХАНИЗМЫ АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТИ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭПИДЕМИОЛОГИЯ НОЗОКОМИАЛЬНЫХ ШТАММОВ SALMONELLA ENTERICA СЕРОВАР TYPHIMURIUM (26.09.2012)

Автор: Козырева Варвара Константиновна

Таким образом, результаты MLVA-типирования также подтверждают данные PFGE для ранее выделенных изолятов (до 2003 г) и свидетельствуют о том, что все цефотаксиморезистентные изоляты сальмонелл, выделенные на территории России, Беларуси и Казахстана в ходе вспышек нозокомиального сальмонеллеза в период с 1996 по 2009 гг., представляют одну клональную группу, и существенно отличаются по совокупности молекулярно-генетических характеристик от чувствительных штаммов S. Typhimurium, выделенных в тех же стационарах. Изоляты, принадлежащие к 7 MLVA-типам были получены как минимум из двух разных регионов, что наглядно отражает легкость распространения клонов, принадлежащих указанной клональной группе. Профиль MLVA CTX-M-2-продуцирующего штамма S. Typhimurium из Аргентины отличался от ближайшего MLVA-типа, найденного в Смоленске, по двум локусам, что позволяет отнести его к описанной клональной группе.

MLST-типирование пяти цефотаксиморезистентных изолятов, принадлежащих к основным MLVA-типам и выделенных в разных географических районах (MLVA-тип A- Санкт-Петербург, D- Москва, K- Иркутск, L- Караганда,Q- Гомель), показало наличие у них идентичных аллельных профилей aroC-dnaN-hemD-hisD-purE-sucA-thrA (116-7-12-9-5-9-2), определяющих принадлежность к сиквенс-типу 328 (ST328). ST328 отличается единственной мутацией в гене aroC от сиквенс-типа ST19 (10-7-12-9-5-9-2), к которому был отнесен взятый для сравнения штамм из Аргентины (MLVA-тип T). Таким образом, MLST типирование подтвердило генетическую родственность CTX-M-5-продуцирующих штаммов S. Typhimurium, показанную с помощью MLVA. Поскольку распространенный в России, Беларуси и Казахстане сиквенс-тип ST238 является однолокусным вариантом сиквенс-типа ST19, отдаленная родственность наших изолятов и аргентинского штамма, выявленная с помощью MLVA, также была подтверждена MLST-типированием.

Таким образом, результаты всех трех использованных нами методов генетического типирования PFGE, MLVA и MLST свидетельствуют о клональном характере распространения госпитальных штаммов S. Typhimurium, резистентных к современным цефалоспоринам.

Молекулярная характеристика детерминант резистентности к (-лактамам. У всех исследованных изолятов методом ПЦР в реальном времени и последующего секвенирования были выявлены гены blaCTX-M-5, кодирующему ранее описанный у S. Typhimurium вариант БЛРС - CTX-M-5. При амплификации с праймерами к внутренним последовательностям генов tnpA ISEcp1 и blaCTX-M-5, у всех изолятов был получен характерный ПЦР-фрагмент длиной около 470 пн. ПЦР тест на наличие сцепления гена blaCTX-M с ISCR1 не дал положительных результатов ни для одного из исследованных изолятов, кроме CTX-M-2-продуцирующего штамма CAS-5 из Аргентины, взятого для сравнения. Таким образом, результаты ПЦР картирования свидетельствуют о наличии характерной для blaCTX-M-5 ассоциации с инсерционной последовательностью ISEcp1 [Bradford, 1998].

ПЦР-анализ на наличие генов других распространенных (-лактамаз молекулярных классов А и D выявил присутствие blaTEM у 4 (4,5%) и blaOXA-1-подобных генов у 66 (75%) изолятов. Гены SHV (-лактамаз не были обнаружены. Наличие OXA-1-подобных (-лактамаз, которые проявляют устойчивость к ингибированию клавулановой кислотой и тазобактамом [Livermore, 1995], коррелировало с резистентностью к пиперациллину-тазобактаму.

Анализ CTX-M-кодирующих плазмид. При конъюгативном переносе плазмид выявлено 2 типа трансконъюгантов, отличающихся по фенотипу резистентности. Трансконъюганты первого типа были получены от большинства исследованных изолятов при культивировании на среде с рифампицином и ампициллином с высокой частотой (10-3-10-4) и обладали резистентностью к пенициллинам, комбинациям пенициллинов с ингибиторами и не-(-лактамным антибиотикам, но проявляли чувствительность к оксиимино-(-лактамам. С помощью ПЦР у трансконъюгантов данного типа были выявлены только гены OXA-1-подобных пенициллиназ.

Трансконъюганты второго типа были получены всего от двух цефотаксиморезистентных изолятов S. Typhimurium на среде, содержащей рифампицин и цефотаксим, с гораздо меньшей частотой (10-7-10-8). Тем не менее, перенос плазмид, обеспечивающих резистентность к цефотаксиму, при конъюгации с низкой частотой свидетельствует о возможности их ко-мобилизации другими плазмидами. Эти неавтоконъюгативные плазмиды обеспечивали резистентность только к пенициллинам и оксиимино-цефалоспоринам, связанную с наличием в их составе генов БЛРС СТХ-М-5.

(размером около 7-8 тпн на электрофорезе). Рестрикционный анализ плазмид, выделенных от трансформантов, показал, что все они могут быть отнесены к одному из четырех типов (Рис. 3). Наиболее распространенный рестрикционный профиль A1 был характерен для 20 изолятов, 11 из которых были выделены в стационарах Беларуси, 8 – в России и 1 – в Казахстане. Плазмиды с остальными, минорными профилями A2, А3 и А4 отличались от А1 единичными изменениями в сайтах рестрикции. То есть, все четыре типа CTX-M-5-кодирующих плазмид являлись сходными между собой по данным рестрикционного анализа.

Рис. 3. Рестрикционный анализ CTX-M-5-кодирующих плазмид: А) рестрикция эндонуклеазой PstI, Б) рестрикция эндонуклеазой PvuII.

A1-A4? репрезентативные рестрикционные профили CTX-M-5-кодирующих плазмид;

М- маркер молекулярной массы ?/BstEII+pUC18/HaeIII.

Полное секвенирование последовательности четырех типов плазмид, выявленных с помощью рестрикционного анализа, подтвердило идентичность их генетического каркаса, включающего гены мобилизации (mobA, mobB, mobC, mobD), инициации репликации, гипотетическую открытую рамку считывания (orfX), мобильного элемента ISEcp1 и (-лактамазы CTX-M-5 (Рис. 4).

Рис. 4. Cравнение нуклеотидных последовательностей CTX-M-5-кодирующих плазмид.

Черные стрелки- предполагаемые кодирующие регионы и ключевые структурные элементы: консервативные гипотетический протеин (orfX), мобилизационные белки (mobA-D), сайт репликации, гены (-лактамаз (blaCTX-M-5, blaTEM-1), инсерционные последовательности (ISEcp1, IS1), транспозаза (tnpA) и резолваза (tnpR) транспозона Tn3. Серые стрелки- консервативная часть плазмид.

Отсутствие tra оперона, ответственного за конъюгационный перенос, при наличии полного набора генов мобилизации в консервативном каркасе описанных плазмид поддерживает наши данные о переносе CTX-M-5-кодирующих плазмид от двух изолятов при конъюгации с низкой частотой и свидетельствует о том, что данные плазмиды являются неавтоконъюгативными, но способными к ко-мобилизации другими плазмидами. Описанным плазмидам было присвоено название «pCTXM5» в сочетании с номерами соответствующих изолятов. Полные нуклеотидные последовательности плазмид депонированы в базу данных GenBank. Плазмида pCTXM5-637 (полная нуклеотидная последовательность депонирована в GenBank под номером JX017306), с самым частым типом рестрикции А1, являлась наиболее простой и обладала наименьшим размером- 7438 пн. Плазмиды pCTXM5-1845 (GenBank № JX017309) и pCTXM5-1358 (GenBank № JX017308) с рестрикционными профилями А2 и А3, соответственно, были крупнее (8215-8216 пн) и отличались от pCTXM5-637 вставкой IS1-подобных элементов, нуклеотидные последовательности которых незначительно варьировали. Наиболее крупная плазмида pCTXM5-891 (GenBank № JX017307) с профилем рестрикции А4 отличалась от pCTXM5-637 наличием транспозона Tn3-типа, который нес в своем составе ген TEM-1 (-лактамазы. Наиболее распространенная плазмида pCTXM5-637 может считаться предшественником других типов плазмид и эволюционировала путем приобретения мобильных элементов IS1 (в случае pCTXM5-1358 и pCTXM5-1845) или Tn3 (pCTXM5-891).

ПЦР-типирование CTX-M-5-кодирующих плазмид позволило детектировать специфическую последовательность, соответствующую консервативному каркасу плазмид pCTXM5-типа у 80 (90,9%) цефотаксиморезистентных изолятов. Однако, у восьми цефотакcим-резистентных изолятов (3 изолята из Томска; 2- из Караганды; 1- из Иркутска; 1 – из С.-Петербурга; 1- из Витебска), имеющих ген blaCTX-M-5, сцепленный с ISEcp1, не удалось детектировать наличие плазмид путем ПЦР-типирования, а также осуществить выделение и перенос pCTXM5-плазмид путем трансформации или конъюгации, что можно объяснить ISEcp1- опосредованной транслокацией гена blaCTX-M на хромосому, примеры которой были описаны в ряде публикаций [Hopkins, 2006; Mendonca, 2007; Fabre, 2009; Sun, 2010]. ПЦР-типирование показало отcутствие плазмид pCTXM5-типа у эпидемиологически несвязанных изолятов: цефотаксимочувствительных внебольничных изолятов S. Typhimurium и у CTX-M-2-продуцирующего аргентинского штамма CAS-5.

Таким образом, локализация генов blaCTX-M-5 на схожих, не поддающихся самостоятельному переносу плазмидах поддерживает данные о клональном распространении цефотаксиморезистентных нозокомиальных штаммов S.Typhimurium. Более того, описанные плазмиды являются специфичными для данной клональной группы S. Typhimurium и, покуда, не были найдены у штаммов S. Typhimurium других генетических линий.

Молекулярная характеристика детерминант резистентности к хинолонам. У исследованных нами изолятов S. Typhimurium резистентность к хинолонам во всех случаях была вызвана различными точечными мутациями приводящими к аминокислотным заменам в QRDR области субъединицы А ДНК-гиразы (GyrA): Asn-87, Gly-87, Tyr-87 и Phe-83 (Рис. 5). При этом, у чувствительных к налидиксовой кислоте изолятов соответствующие мутации не были обнаружены. Таким образом, фенотип чувствительности к налидиксовой кислоте строго коррелировал с генотипом gyrA.

Мутация Количество (%) изолятов Диапазон МПК, мг/л

NAL CIP

Нет (WT) 50 (56,8%) 4 - 16 ?0,03 - 0,06

Asn-87 25 (28,4) 128 - ?512 0,125 - 0,5

Gly-87 3 (3,4%) 256 - ?512 0,06 - 0,5

Tyr-87 2 (2,3%) 128 - 256 0,125 - 0,25

Phe-83 8 (9,1%) ?512 0,25 - 0,5

Рис.5. Распределение исследованных изолятов S.Typhimurium по МПК налидиксовой кислоты (NAL) и ципрофлоксацина (CIP) в зависимости от характера мутаций в QRDR GyrA.

Большинство штаммов с характерными мутациями в QRDR GyrA также проявляли устойчивость низкого уровня к ципрофлоксацину, однако один изолят с заменой Gly-87 формально сохранял чувствительность к ципрофлоксацину (МПК 0,06 мг/л). Данное наблюдение свидетельствует, на наш взгляд, о том, что налидиксовая кислота является более чувствительным маркером для выявления хромосомно-опосредованной резистентности к хинолонам.

Выявленные в ходе данного исследования мутации в 83 и 87 позиции GyrA являются типичными для хинолонорезистентных клинических штаммов разных видов семейства Enterobacteriaceae. Эффект данных мутаций хорошо изучен и для штаммов сальмонелл. Наиболее часто у исследованных нами изолятов встречались замены на Asn (аспарагин) в 87 позиции (28,4%) и на Phe в 83 (9,1%). Мутация Phe-83, как и было показано ранее, была связана с более высокими значениями МПК как налидиксовой кислоты ((512мг/л), так и ципрофлоксацина ((0,25мг/л).

Ввиду показанной нами клональной родственности исследованных изолятов, было бы логично предположить, что мутации в хромосомном гене gyrA должны быть одинаковыми у всех штаммов, резистентных к хинолонам. Однако, данные кластерного анализа штаммов, выполненного по результатам MLVA-типирования (Рис. 6), свидетельствуют о том, что распространение резистентности к хинолонам в изучаемой генетической линии S. Typhimurium лишь отчасти носит клональный характер и в значительной мере связано с независимым приобретением мутаций в gyrA исходно чувствительным штаммом.

Кластеризация MLVA-профилей на основании алгоритма Минимального остовного дерева. MLVA-типы, отличающиеся не более чем на 2 локуса, объединены в одну клональную группу (выделена серым фоновым цветом). Заливка круга отражает доли изолятов с разными мутациями QRDR gyrA, принадлежащих данному MLVA-типу.

Тест на гипермутбельность. У исследованных нами изолятов частота спонтанных мутаций устойчивости к налидиксовой кислоте составила приблизительно 1 ( 10-5 (соответствует увеличению частоты мутаций на 4 порядка по сравнению с обычными штаммами [Levy, 2004]), что позволило считать их гипермутабельными.

Также при постановке скринирующего теста с диском налидиксовой кислоты у всех штаммов S. Typhimurium, не проявляющих резистентность к налидиксовой кислоте, аналогично с контрольным штаммом-мутатором E.coli GM2995 (mutD5), наблюдался рост многочисленных мутантных колоний внутри зоны подавления роста. Подобного роста у немутабельного контроля не замечено (Рис. 7). У произвольно выбранных мутантов, полученных in vitro, методом секвенирования было установлено наличие мутаций в QRDR gyrA, идентичных выявленным у хинолонорезистентных клинических изолятов.

Рис. 7. Примеры выявления фенотипа гипермутабельности с помощью быстрого теста с диском налидиксовой кислоты

А, Б – Клинические изоляты S. Typhimurium; В – отрицательный контроль – E. coli ATCC(25922; Г – положительный контроль – E. coli GM2995. Стрелкой отмечены мутантные колонии внутри зон подавления роста.

Фенотип гипермутабельности наблюдался у всех исходно чувствительных к налидиксовой кислоте изолятов, относящихся к разным MLVA-субтипам внутри одной клональной группы и, тем самым, разнородность мутаций резистентности к фторхинолонам не противоречит результатам субвидового типирования, а свидетельствует о распространении единого гипермутабельного клона.

Таким образом, в течение долгого времени в стационарах на обширной территории Российской Федерации и сопредельных государств циркулирует успешный полирезистентный клон S. Typhimurium, устойчивый к цефалоспоринам III-IV поколений, благодаря продукции плазмидно-кодируемой БЛРС CTX-M-5. Причем, неавтоконъюгативные CTX-M-5-кодирующие плазмиды являются важной характеристикой описанного клона и не были обнаружены у изолятов S. Typhimurium неродственных генетических линий. Значительная доля изолятов принадлежащих данному клону резистентна к фторхинолонам, и существует высокая вероятность дальнейшего роста фторхинолонорезистентности среди изолятов внутри клональной группы вследствие их гипермутабельности, которая облегчает приобретение мутаций устойчивости. Большинство изолятов данной группы проявляют ассоциированную устойчивость к антибиотикам разных классов за счет комбинации дополнительных плазмидных и хромосомных детерминант резистентности.

По данным молекулярно-генетического типирования методами мультилокусного секвенирования-типирования (MLST), мультилокусного анализа тандемных повторов (MLVA) и пульс-электрофореза макрорестрикционных фрагментов геномной ДНК (PFGE) цефотаксиморезистентные штаммы Salmonella Typhimurium, вызвавшие вспышки сальмонеллеза в стационарах на территории России, Беларуси и Казахстана с 1996 по 2009 гг., принадлежат к одной клональной группе.

Резистентность нозокомиальных штаммов S. Typhimurium к цефалоспоринам III-IV поколения и азтреонаму обусловлена наличием у них генетических детерминант, кодирующих (-лактамазы расширенного спектра действия CTX-M-5, тогда как устойчивость к ингибиторозащищенным пенициллинам связана с генами (-лактамаз OXA-1 типа.

Ген приобретенной (-лактамазы CTX-M-5 связан с инсерционным элементом ISEcp1 и находится в составе ранее не описанных сходных между собой неавтоконъюгативных плазмид, которые способны к мобилизации другими конъюгативными плазмидами.

Резистентность к хинолонам во всех случаях является результатом единичных аминокислотных замен в области, определяющей устойчивость к хинолонам (QRDR), А-субъединицы ДНК-гиразы (Asn-87, Phe-83, Gly-87, Tyr-87)


загрузка...