Технология производства и обеспечение качества синбиотиков ЛАКТОСУБТИЛ-ФОРТЕ и АВИЛАКТ-ФОРТЕ. эффективность их применения в птицеводстве (26.09.2011)

Автор: Неминущая Лариса Анатольевна

С целью унификации процесса культивирования штаммов-продуцентов нами исследована возможность культивирования микроорганизмов с использованием универсальной питательной среды на основе ферментолизата отходов зерносырья.

3.3.1.1. Технология изготовления пробиотиков АВИЛАКТ-1К и АВИСТИМ.

Культивирование бактерий – пробиотиков L. acidophilus и B. subtilis. Посевной материал (P.s.) для культивирования бактерий в реакторе получали из рабочей посевной серии (W.s.) при выращивании в колбах с питательной средой на основе молочной сыворотки (МС) или ферментолизата отходов зерносырья (ФЗ).

Состав среды МС: сухая молочная сыворотка – 30г; (NH4)2SО4 – 0,05г; КН2РО4 – 0,03г; дрожжевой автолизат – 0,01дм3; вода водопроводная – 1,0 дм3. Характеристика среды после стерилизации (0,5 атм 30 мин.): редуцирующих веществ (РВ) – 1,6%; NH4 – 0,9 г/ дм3; Р2О5 – 0,5 г/ дм3.

Состав среды ФЗ: (NH4)2SО4 – 0,05г; КН2РО4 – 0,02 г; дрожжевой автолизат - 10 см3, мел - 3 г; ферментолизат отходов зерносырья - 1,0 дм3. Среду стерилизовали при 1 атм. в течение 40 минут. Для получения ферментолизата смесь измельченной ржи и пшеничных отрубей (в соотношении 30:70) разбавляли водой (гидромодуль 1:6 или 1:8) и подвергали последовательно: термообработке при температуре (80±1)°С в течение 1 часа; обработке в роторно-пульсационном аппарате при температуре (75±1)°С в течение 40 мин.; ферментолизу зерновой пульпы глюкавамарином ГЗХ при температуре (55±1)°С в течение 4 часов при рН 5,0-5,2. Среду стерилизовали при 1 атм 40 мин. Характеристика среды после стерилизации: редуцирующих веществ РВ – 2,5-3,0%; NH4 – 0,9 -1,0 г/ дм3; Р2О5 – 0,4-0,5 г/дм3.

Бактерии L. acidophilus культивировали в термостате при температуре (37±0,5)0С, в течение 70-72 часов при периодическом перемешивании (каждые 12 часов), B.subtilis - на качалке (g=200 об/мин) при температуре (37±1)0 С в течение 40-48 часов. После окончания процесса состояние каждой культуры контролировали микроскопированием на отсутствие посторонней микрофлоры и соответствие культурально-морфологическим признакам, определяли накопление клеток, которое было одинаковым для обеих сред и составляло для L. acidophilus 1х109 – 1х1010 КОЕ/см3 , для 1х1010 – 1х1011КОЕ/см3 (количество спор 40-60%). Полученный посевной материал использовали для культивирования бактерий в биореакторе (V=30 и 300дм3).

Режим культивирования L. acidophilus в реакторе: количество P.s. составляло 8-10% от объема питательной среды ФЗ; температура - 31-320 С, время – 20-24 часа; перемешивание в течение первых двух часов (по 15 минут в час, g=180 об/мин.); начальное значение рН - 7,0-7,2; при культивировании рН поддерживали на уровне 6,5-7,0 (6%-ной аммиачной водой). Конечная концентрация сухих веществ в биомассе - 10,0-12,0 г/дм3; концентрация сахаров в среде снижалась до 0,2%. Накопление лактобактерий - не менее 5х109 КОЕ/см3. Режим культивирования B.subtilis: объем посевного материала - 5-6%; температура - 37-380С, время 36-48 часов; перемешивание мешалкой (300 об/мин); аэрация (1 дм3 воздуха/1 дм3 среды/мин.); начальное значение рН 7,0-7,2, в процессе культивирования не регулировалось. Конечная концентрация бактерий - 1х1010 – 1х1011 КОЕ/см3, количество спор 30-50%.

Состояние культур бактерий контролировали микроскопированием.

Изготовление готовых форм препаратов. Для пробиотиков разработано две готовые формы – жидкая и сухая. После культивирования и контроля качества продукт в первом случае фасовали в первичную тару и укупоривали, во втором – фасовали в кассеты и подвергали сублимационному высушиванию по режимам, разработанным для двух питательных сред: МС и ФЗ. Количество живых бактерий в сухом материале составляла не менее 3х109КОЕ/г и 1х1011КОЕ/г для L. acidophilus и B. subtilis соответственно. Жидкий препарат расфасовывали в стеклянную или полиэтиленовую тару, предназначенную для лекарственных средств и пищевых продуктов. Сухой препарат расфасовывали в полимерные пакеты.

3.3.1.2. Технология производства пребиотика АВИСТИМ. Культивирование гриба F. sambucinum. Посевной материал (P.s) получали культивированием в колбах со средой МС или ФЗ при температуре (26±1)0С на качалке (g=160 об/мин). Время культивирования пассажей: первого – 96 часов, второго – 48часов, третьего и последующих – 24 часа. Контролировали микроскопированием состояние культуры, определяли накопление биомассы - 5-6 г/дм3 (одинаковое для обеих сред) и использовали для культивирования в биореакторе при следующих параметрах: объем P.s. - 2-4%; температура - (27±2)0С; время – 30-34 часа; перемешивание постоянное (g=120 об/мин.); барботаж воздухом (при 1,1 атм); остаточное давление 0,25 атм; начальное значение рН 5,5-6,0; процесс заканчивали при снижении рН до 4,1±0,5. Через 12 часов после начала процесса отбирали пробы (1 раз каждые 3 часа) для определения рН среды, концентрации биомассы, контроля состояния мицелия. После окончания процесса культуральную среду подкисляли до рН 3.,0-3,5 и выдерживали в течение 1-3 часов. Концентрация биомассы составляла 10-12 г/дм3, содержание белка - 46-53%.

Получение готовой формы препарата. КЖ отделяли от биомассы фильтрацией на нутч-фильтрах (фильтрующая ткань типа лавсана, разрежение 0,05-0,07 МПа, скорость 90-110 л/м2/мин.), подвергали стерилизующей фильтрации и расфасовывали в стеклянную или полиэтиленовую тару.

3.3.1.3. Технология производства белковой кормовой добавки ЦЕРЕВЕТ. Культивирование дрожжей-сахаромицетов. Посевной материал (P.s.) культивировали в колбах со средой МС или ФЗ на качалке (g=160 об/мин.) при температуре (33±1)0 С и рН 4,5-5,5 в течение 24-36 часов до полного потребления свободных углеводов. Контролировали состояние культуры, определяли концентрацию биомассы (23-25 г/дм3), содержание остаточных РВ в культуральной среде (0,1-0,2%) и использовали для культивирования в биореакторе при следующих параметрах: объем посевного материала – 4-5%; (P.s) начальное значение рН 5,0±0,5; температура - (31±1)0С; время - 18-19 часов; постоянное перемешивание (g=120 об/мин.), аэрация (1 дм3 воздуха/1 дм3 среды, расход воздуха 7-9 м3/час); конечная концентрация биомассы - 20-25 г/дм3, содержание РВ в среде - 0,1-0,2%.

В качестве биокатализатора при культивировании дрожжей в промышленном биореакторе использовали КЖ гриба, которую добавляли в ферментолизат в количестве 0,1-1,0% от объема среды. При добавлении в питательную среду КЖ сокращалось время накопления биомассы с 19 до 10 часов, увеличивалась скорость потребления сахаров (на 32,1%), минерального азота (на 21,5%) и фосфора (на 45,4%).

Получение готовой формы препарата. Биомассу подвергали плазмолизу при 800 С в течение 1 часа, контролировали на отсутствие живых клеток и сушили на распылительной сушилке типа Niro Atomizer (температура на входе – 3000 С, на выходе - 950С). В полученном продукте содержание сырого протеина составляло 40-45%, истинного белка – 30-38%. Сухой препарат фасовали в полимерные пакеты.

3.3.2. Разработка схемы доклинических исследований (ДИ) препаратов.

Исходя из общих требований к проведению ДИ, нами разработана для данного класса препаратов схема ДИ по основным показателям - безопасности, специфической активности и стабильности. Определена номенклатура показателей, методы их определения и допустимые значения. Методическую часть работы выполняли с использованием лабораторных рабочих эталонных материалов (ЛРЭМ).

3.3.2.1. Определение безопасности. Поскольку разрабатываемые препараты предназначены для птицы, в качестве критериев оценки безопасности нами определены: отсутствие контаминации препарата посторонней микрофлорой, отсутствие токсичности для эмбрионов кур и безвредность для цыплят суточного возраста. Поскольку КЖ гриба впервые использована в качестве пребиотика для птиц, для нее введен дополнительный контроль - отсутствие потенциального раздражающего действия на слизистые оболочки ЖКТ. Требования к кормовой добавке ЦЕРЕВЕТ гармонизированы с существующей в РФ базой НД на кормовые добавки (в том числе и кормовые дрожжи), для чего введены дополнительные контроли на отсутствие металломагнитных примесей и живых клеток дрожжей, а контроль на отсутствие контаминации посторонней микрофлорой заменен на определение токсичности экспресс-методами на инфузориях и общей бактериальной обсемененности.

Для контроля безопасности нами разработаны новые методы с использованием биотестирования на моделях доорганизменного уровня: тест эмбриотоксичности и модифицированный ХЕТ-КАМ тест.

Токсичность для куриных эмбрионов (тест эмбриотоксичности). Развивающиеся эмбрионы кур (РЭК) занимают среднее положение по чувствительности к токсическим веществам между лабораторными животными и культурой клеток и являются удобной моделью для оценки острой токсичности. Нами разработан и использован в ДИ тест эмбриотоксичности - экспресс-тест, принцип которого заключался в следующем: 9-10 суточным SPF-эмбрионам в аллантоисную полость вводили 0,1-0,2 см3 препарата и инкубировали при температуре (37+0,5)оС до вывода цыплят, учитывая раз в сутки количество погибших эмбрионов. Критерием эмбриотоксичности препарата являлась эмбриональная смертность, суммированная по всем дням инкубации, а также состояние вылупившихся цыплят (отсутствие уродств и внешних патологий). Контроль служили интактные и инокулированные физиологическим раствором (ФР) по 0,1-0,2 см3 эмбрионы.

Потенциальное раздражающее действие на слизистые оболочки ЖКТ. Для определения потенциального раздражающего действия КЖ на слизистые оболочки ЖКТ использовали ХЕТ-КАМ тест в нашей модификации. Принцип ХЕТ-КАМ теста: раздражающее действие исследуемого вещества моделируется на хориоаллантоисной оболочке (ХАО) 9-10 суточных развивающихся SPF эмбрионов кур (Лукьянов А.С., 1998). На ХАО наносили 0,5 см3 испытуемого раствора и наблюдали с помощью бинокулярного микроскопа за состоянием оболочки под каплей раствора. При отсутствии раздражающего действия за период наблюдения (1-3 мин) оболочка не должна нарушаться, сеть кровеносных сосудов и капилляров должна функционировать нормально. Изменения на оболочке могут выражаться в замедлении тока крови и тромбозе отдельных капилляров, покраснении оболочки или выходе из капилляров форменных элементов крови, остановке кровотока. Поскольку исследуемые объекты относятся к нетоксичным соединениям и не могут обладать сильным раздражающим действием, тест нами модифицирован: 1) при наблюдении за изменениями на ХАО выбирали поле с мелкими сосудами и капиллярами; 2) время наблюдения увеличено до 10 минут; 3) реакцию считали положительной (+), если изменения наступали через 3-5 минут наблюдения; слабоположительной (+-) при наблюдении изменений в интервале 5-10 минут; отрицательной, если изменения не наступали в течение 10 минут; 4) состояние ХАО фотографировали; 5) в качестве положительного контроля использовали 70%-ный этиловый спирт, обладающий выраженным раздражающим действием на слизистые, отрицательного контроля - физиологический раствор, не раздражающий слизистые.

Определение безвредности для суточных цыплят. Суточным цыплятам-бройлерам перорально однократно вводили препараты АВИЛАКТ-1К и АВИСУБТИЛ в дозах 109КОЕ и 1010КОЕ/гол. соответственно; АВИСТИМ выпаивали в дозе, равной 50% суточного объема воды; ЦЕРЕВЕТ давали с кормом (3% от суточной нормы корма). Цыплят наблюдали в течение 10 суток, регистрируя их состояние (активность, аппетит, динамику массы, поведенческие реакции) и уровень падежа.

3.3.2.2. Определение специфической активности. Специфическую активность пробиотиков оценивали по подлинности, количеству жизнеспособных микроорганизмов, антагонистической активности in vitro и in vivo, резистентности к антибиотикам. Для биологически активных добавок (в частности пребиотиков), которые являюстя поликомпонентными по своему составу и полифункциональными по механизму действия, в настоящее время не существует общепринятых подходов к определению показателей их специфической активности. Нами определены интегральные показатели состава и определяемого им физиологического действия. Благодаря своему составу КЖ может обладать антиоксидантным действием, которое является одним из антистрессовых механизмов, его величина (антиоксидантная активность - АА) может служить показателем специфической активности препарата. Поэтому для характеристики пребиотика выбраны следующие показатели: содержание сухих веществ, величина рН и АА. Специфическую активность кормовых добавок характеризовали по питательной ценности, которая согласно НД на кормовые добавки определяется содержанием в них белка, углеводов, липидов, а также сухих веществ.

Определение подлинности бактерий-пробиотиков устанавливали общепринятым методом окрашивания по Граму.

)определяли стандартным методом подсчета колоний. Метод характеризуется большим разбросом данных, поэтому проведена стандартизация условий определения количества жизнеспособных лактобактерий по разработанной нами и утвержденной директором ВНИТИБП «Методике построения гистограмм для оценки стабильности и точности технологических процессов и операций». По результатам статистической обработки многократного (n = 68) определения количества жизнеспособных лактобактерий в образцах ЛРЭМ построена гистограмма распределения данных, определено среднее значение количества жизнеспособных бактерий

= (6,7 ± 0,5)х108 КОЕ/см3. Характер гистограммы свидетельствовал о нормальном характере распределения данных и, следовательно, о стабильности результатов определения показателя в контролируемых сериях препарата. Если полученное для ЛРЭМ значение количества жизнеспособных лактобактерий укладывалось в интервал (6,7 ± 0,5)х108 КОЕ/см3, то условия определения считали стандартными, а полученное значение в контролируемой серии – достоверным при указанной величине ошибки определения.

Определение антагонистической активности (АнтА) препаратов АВИЛАКТ-1К и АВИСУБТИЛ по отношению к патогенным микроорганизмам в опытах in vitro. По данным, полученным при характеристике штаммов и контроле посевных материалов, установлены минимально допустимые значения АнтА для L. acidophilus (зона задержки роста эшерихий – не менее 7 мм, сальмонелл – не менее 6 мм) и B. subtilis (зона задержки роста эшерихий – не менее 15 мм, сальмонелл - не менее 10 мм). Для стандартизации условий определения АнтА использовали образцы ЛРЭМ. Если получали значения АнтА ниже заданных показателей, проводили повторное исследование параллельно с образцом ЛРЭМ. При подтверждении полученного результата серию считали не прошедшей контроль по данному показателю. Наличие антагонистической активности препаратов, установленное в опытах in vitro, подтвердили исследованиями АнтА в опытах in vivo.

Определение антагонистической активности пробиотиков в опытах in vivo. Величину АнтА определяли по выживаемости цыплят при контрольном заражении патогенным изолятом E. coli, выделенным в ЭПХ из организма больной птицы. Работа по выделению изолята и определению его патогенности для мышей (500 млн.кл./гол.) проведена совместно с ВГНКИ ветпрепаратов. Для цыплят 10-суточного возраста при внутримышечном введении 10-кратных разведений культуры E.coli определили летальную дозу (ЛД50) и ее доверительный интервал (Р? 0,05) для контрольной группы (К) и групп, получавших L. acidophilus и B.subtilis (Л и Б соответственно): lg ЛД50 (К) = - 2,9 ( 0,2; lg ЛД50 (Л) = - 2,4 ( 0,2 и lg ЛД50 (Б) = - 1,92 ( 0,2. Показано, что препараты обладали антагонистической активностью по отношению к патогенной культуре E. сoli, т.к. защищали 30 и 40% птицы (соответственно) при контрольном заражении.

Определение резистентности препаратов АВИЛАКТ-1К и АВИСУБТИЛ к антибиотикам. Для стандартизации условий определения резистентность препаратов сравнивали со значениями, полученными при характеристике штамма-продуцента и контроле посевных материалов. Если получаемые значения были ниже заданных показателей, проводили повторное исследование параллельно с образцом ЛРЭМ.

Определение антиоксидантной активности (АА) пребиотика АВИСТИМ. С помощью прибора «Яуза-ААА-01» на базе ОАО «НПО Химавтоматика» нами исследована АА трех образцов КЖ, полученных при изготовлении посевного материала, в сравнении с маркером дигидрокверцетином. Препарат АВИСТИМ обладал выраженной антиоксидантной активностью, превышающей АА маркера в 5,5-5,9 раза.

Для стандартизации состава пребиотика АВИСТИМ общепринятыми методами определили содержание в КЖ сухих веществ (ГОСТ Р 52838) – не менее2,5% и величину рН (фармстатья ОФС 42-0048-07, Х11 изд. Гос. Фармакопеи РФ) - 6,6-7,0.

Состав кормовой добавки ЦЕРЕВЕТ стандартизовали по минимально допустимому содержанию белка (38% АСВ) и максимально допустимому содержанию липидов (10%) и углеводов (28%). Сравнение химического состава ЦЕРЕВЕТа и аналогичной ему лечебно-профилактической добавки «Естур» (США) показало, что ЦЕРЕВЕТ содержал больше белка (на 36,3%), макро- и микроэлементов (фосфора - на 13,8%, кальция - на 39,4%, железа - в 3 раза, марганца - в 2,8 раза), аминокислот (лизина, аргинина, фенилаланина, треонина и триптофана – в 1,5-2 раза).

3.3.2.3. Определение стабильности препаратов. Стабильность препаратов оценивали с целью определения их сроков годности и условий хранения.

Исследование стабильности препарата АВИЛАКТ-1К. На образцах ЛРЭМ определяли сохранность живых бактерий (в жидкой и сухой формах) при повышенных температурах (термостабильность) и при длительном хранении. Исследование термостабильности осуществляли согласно разработанным с нашим участием «Методическим рекомендациям по исследованию стабильности иммунобиопрепаратов на этапе разработки и в условиях действующего производства».

Исследование термостабильности жидкой формы препарата. При прогревании жидких образцов трех серий препарата в течение 15 минут при температурах 40, 45, 50, 55, 600С показано, что при 500С в течение 15 минут количество живых клеток снижалось, в среднем, на 52%, поэтому при 500С исследовали кинетику инактивации бактерий в течение 5, 10, 15, 20, 25 и 30 минут. Статистическая обработка показала, что снижение количества жизнеспособных бактерий в суспензии зависело от продолжительности теплового воздействия и описывалось (коэффициент корреляции r*= -0,92) кинетическим уравнением первого порядка lg y = lg y0 – Kt, где: y0 - исходная активность препарата; y – величина активности через время t; K – константа скорости инактивации (сек-1). Рассчитана величина КТ = -1,6х10-3 сек-1. В качестве экспресс-теста оценки стабильности препарата АВИЛАКТ-1К в жидкой форме рекомендован тест «ускоренного старения» - 500С в течение 15 минут.

Исследование термостабильности сухого препарата проводили по аналогичной схеме. При 600С в течение 30 минут количество живых клеток снижалось, в среднем, на 44,4%. При температуре 600С (10, 20, 25, 30, 40 и 50 минут) исследовали кинетику инактивации бактерий. Показано, что, как и для жидкого препарата, снижение количества жизнеспособных бактерий в суспензии имело линейный характер (коэффициент корреляции r*= -0,93), КТ = -3,8х10-4 сек-1. Условия теста «ускоренного старения» для препарата в сухой форме - 600С в течение 30 минут.

Стабильность препарата при хранении определяли по снижению количества живых лактобактерий в течение 12 месяцев при 8-100С и при комнатной температуре 18-200С. Установлено, что с учетом определенной нами ошибки титрования (±0,5 lg КОЕ/см3) достоверное снижение количества жизнеспособных лактобактерий в препарате начиналось: для жидкой формы через 4 месяца хранения при 8-10(С и после 1месяца - при 18-20(С; для сухой формы через 8 месяцев хранения при 8-10(С и после 4 месяцев - при 18-20(С. Исходя из этого, определен срок годности жидкого препарата 3месяца, сухого препарата - 9 месяцев при температуре 8-10(С.

Исследование стабильности препарата АВИСУБТИЛ. Стабильность препарата определяли по снижению количества живых бактерий при 8-100С и при комнатной температуре 18-200С в течение 12мес. Показано, что жизнеспособность бактерий в препарате достоверно сохранялась: для жидкой формы в течение 10 месяцев хранения при 8-10(С и 8 месяцев - при 18-20(С; для сухой формы в течение 12 месяцев хранения при 8-10(С и 18-20(С. Установлен срок годности жидкого препарата 9 месяцев, сухого препарата - 12 месяцев при 8-10(С.

Исследование стабильности препарата АВИСТИМ. Стабильность препарата оценивали по отсутствию осадка в течение 12 месяцев хранения при температуре 8-100С. Осадок появлялся через 4-5 месяцев, рН препарата за этот период не менялся. Определили срок хранения препарата – 3 месяца при 8-100С.

Срок и условия хранения препарата ЦЕРЕВЕТ установлены согласно аналогичным требованиям, заложенным в нормативную документацию на родственные препараты кормовых дрожжей (ГОСТ 20083-74): 6 месяца при 8-100С.

3.3.3. Изготовление и контроль опытно-промышленных серий препаратов.


загрузка...