Технология производства и обеспечение качества синбиотиков ЛАКТОСУБТИЛ-ФОРТЕ и АВИЛАКТ-ФОРТЕ. эффективность их применения в птицеводстве (26.09.2011)

Автор: Неминущая Лариса Анатольевна

Установлено, что выбранные штаммы лактобактерий (Lactobacillus acidophilus, штамм 1К) и бацилл (Bacillus subtilis, штамм М8) по уровню антагонистической активности к патогенным микроорганизмам и резистентности к антибиотикам удовлетворяют требованиям, предъявляемым к продуцентам пробиотиков. На их основе разработаны новые пробиотики АВИЛАКТ-1К и АВИСУБТИЛ.

Выделен новый штамм мицелиального гриба F. sambucinum, исследована его безопасность, химический состав биомассы и культуральной жидкости (Патент РФ «Штамм гриба Fusarium sambucinum – продуцент биологически активных веществ» №2259209, приор. от 26.03.2004 в соавт.). На основе культуральной жидкости гриба разработан новый пребиотик АВИСТИМ. Установлено антиоксидантное действие культуральной жидкости как показатель биологической активности пребиотиков.

Показана высокая питательная ценность биомассы инактивированных клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae, шт. diastaticus ВКПМ–?-1218, разработана новая белковая кормовая добавка ЦЕРЕВЕТ.

В технологии изготовления входящих в состав синбиотиков препаратов (пробиотиков, пребиотика и белковой кормовой добавки) для культивирования пробионтных бактерий, гриба и дрожжей-сахаромицетов использована универсальная питательная среда на основе ферментолизата отходов зерносырья.

Разработан состав синбиотиков ЛАКТОСУБТИЛ-ФОРТЕ и АВИЛАКТ-ФОРТЕ и способы их применения при выращивании цыплят-бройлеров (Патент РФ «Кормовая добавка для птицеводства и способ выращивания птицы» № 2286066, приоритет от 26.04.04, в соавт.). Установлен синергизм действия препаратов при их применении в составе комплексов.

Эффективность применения синбиотиков при выращивании цыплят-бройлеров определена с использованием широкого спектра показателей: европейский индекс продуктивности (интегральная характеристика зоотехнических параметров выращивания – живая масса и сохранность птицы, затраты корма); качество продукции (содержание белка и жира в мясе, выход мясных частей); экономический эффект; влияние на эффективность вакцинации птицы на модели ньюкаслской болезни (Патент РФ «Способ профилактики болезни Ньюкасла» №2035915, приоритет от 28.12.92г., в соавт.; Патент РФ «Вакцина против болезни Ньюкасла и способ ее применения» №2035917, приоритет от 28.12.92г., в соавт.).

Впервые для обеспечения качества пробиотиков, пребиотика и белковой кормовой добавки в процессе их разработки и производства реализованы:

- методология проектного подхода согласно требованиям ГОСТ Р ИСО 9001-2008 «Системы менеджмента качества. Требования» (алгоритм исследований соответствовал основным этапам разработки и внедрения в производство нового лекарственного средства: научная гипотеза и поисковые исследования; доклинические исследования; разработка технологии производства и наработка опытных партий препаратов; клинические испытания в птицехозяйстве и оценка экономической эффективности);

- схема доклинических исследований безопасности, активности и стабильности препаратов в соответствии с Правилами GLP (обоснован выбор показателей и методы их определения; установлены допустимые границы показателей; разработаны и применены для определения безопасности новые методы биотестирования на моделях доорганизменного уровня - тест эмбриотоксичности на развивающихся эмбрионах кур и модификация ХЕТ-КАМ теста на хориоаллантоисной оболочке куриного эмбриона; изготовлены и использованы в исследованиях стандартные образцы - лабораторные рабочие эталонные материалы).

1.4. Практическая ценность работы. Применение синбиотиков АВИЛАКТ-ФОРТЕ и ЛАКТОСУБТИЛ-ФОРТЕ в птицеводстве способствует повышению продуктивности птицы, обеспечению ветеринарного благополучия птицехозяйств, гарантии качества, биологической и экологической безопасности как самой продукции, так и процесса ее производства.

По разработанной технологии изготовлено 45 серий препаратов. В доклинических исследованиях и производственных испытаниях подтверждена их безопасность и эффективность. В птицехозяйстве проведен 21 научно-производственный опыт и два производственных испытания на цыплятах-бройлерах различных кроссов (суммарное поголовье - 10 000 голов). Разработаны способы применения синбиотиков при различных путях введения препаратов (выпаивание, смешивание с кормом, напыление на гранулы комбикорма). Результаты испытаний включены в «Методические рекомендации по использованию пробиотиков, пребиотиков и симбиотиков в птицеводстве» и «Методические рекомендации по технологии камерной аэрозольной вакцинации цыплят против НБ».

Экономический эффект от применения синбиотиков ЛАКТОСУБТИЛ-ФОРТЕ и АВИЛАКТ-ФОРТЕ при выращивании бройлеров составил (в расчете на 1000 голов) 7862 и 1374 руб. соответственно.

С учетом требований системы менеджмента качества и Правил GMP разработана и утверждена в установленном порядке нормативная документация: на препараты АВИЛАКТ-1К, АВИСУБТИЛ, АВИСТИМ и ЦЕРЕВЕТ - технологические регламенты, стандарты организации (ТУ) и инструкции по применению, на синбиотики ЛАКТОСУБТИЛ-ФОРТЕ и АВИЛАКТ-ФОРТЕ – инструкции по применению.

Опыт применения методологии проектного подхода и доклинических исследований использован в «Методических рекомендациях по разработке и реализации проекта создания нового лекарственного средства», «Рекомендациях по проведению доклинических испытаний новых лекарственных средств для животных и биологически активных добавок к кормам», «Методических рекомендациях по исследованию стабильности иммунобиопрепаратов на этапе разработки и в условиях действующего производства», «Методике определения раздражающего действия лечебно-профилактических препаратов для животных и их ингредиентов с помощью теста на хориоаллантоисной оболочке куриного эмбриона (ХЕТ-КАМ тест)», «Методике определения потенциальной токсичности лечебно-профилактических препаратов для животных и их ингредиентов на куриных эмбрионах (тест эмбриотоксичности)».

Разработан в соавторстве и внедрен ОСТ 100083-95 «Продукция агробиологической промышленности. Технологические регламенты производства. Содержание, порядок разработки, построения, согласования и утверждения.», основные положения которого в 2010 г. актуализированы с учетом требований ГОСТ Р 52249-2009 «Правила производства и контроля качества лекарственных средств» и включены в проект национального стандарта РФ «Средства лекарственные для животных. Технологические регламенты производства. Содержание, порядок разработки, согласования и утверждения». Материалы документов использованы в 2003-2011 г.г. при внедрении системы менеджмента качества на биопредприятиях: ФГУП «Щелковский биокомбинат», «Орловская биофабрика», «Курская биофабрика», ОАО «Покровский завод биопрепаратов».

Результаты работы использованы для обоснования разработанной во ВНИТИБП и одобренной Президиумом Россельхозакадемии (протокол №4 от 21.04.2011) «Концепции научного обеспечения создания и развития региональных биологических предприятий по производству препаратов для защиты животных, растений и средств, повышающих эффективность функционирования агропромышленного комплекса Российской Федерации», а также вошли в лекционный материал курсов повышения квалификации руководителей и специалистов птицеводческих предприятий «Новые технологии и пути повышения эффективности производства мяса бройлеров» г. Сергиев Посад (ГНУ ВНИТИП Россельхозакадемии), 2011г.

1.5. Основные положения диссертационной работы, которые выносятся на защиту:

- характеристика штаммов микроорганизмов - продуцентов пробиотиков, пребиотика и белковой кормовой добавки, входящих в состав синбиотиков;

- система получения и контроля посевного материала для изготовления препаратов АВИЛАКТ-1К, АВИСУБТИЛ, АВИСТИМ и ЦЕРЕВЕТ;

- схема доклинических исследований безопасности, активности и стабильности препаратов, гармонизированная с международными требованиями;

- методы определения безвредности препаратов с помощью биологических тест-систем доорганизменного уровня;

- технология изготовления препаратов с использованием универсальной питательной среды на основе ферментолизата отходов зерносырья;

- антиоксидантное действие как новая характеристика биологической активности пребиотиков;

- эффективность применения синбиотиков при выращивании цыплят-бройлеров; влияние синбиотика АВИЛАКТ-ФОРТЕ на эффективность вакцинации птицы против ньюкаслской болезни;

- способы и экономическая эффективность применения синбиотиков АВИЛАКТ-ФОРТЕ и ЛАКТОСБТИЛ-ФОРТЕ в птицеводстве.

1.6. Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены: в виде ежегодных отчетов по темам госзаданий на заседаниях ученого совета и методической комиссии ВНИТИБП (1991 - 2010 гг.); на секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (2004-2010 гг.); на пяти Международных конгрессах (XI International congress оf the World Veterinary poultry association, Будапешт,1997 г.; І и III Международные ветеринарные конгрессы по птицеводству, Москва, 2005 и 2007 г.г.; конгрессы «Биотехнология-2009, 2011», Москва, 2009,2011г.г.); на 42 Всесоюзных, Республиканских, Международных и Всероссийских конференциях, посвященных научным и практическим проблемам технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов, проводившихся в Москве, Минске, Риге, Киеве, Харькове, Алуште, Петербурге, Саранске, Владимире, Краснодаре, Курске, Пущино, Боровске, Светлогорске, Сергиевом Посаде, Покрове, Щелково (1991 – 2011 гг.).

Разработки удостоены: бронзовой медали и Диплома III степени (Российская агропромышленная выставка «Золотая осень», 2002г.), Дипломов V,VI и VII Международных выставок «Лаборатория Экспо» (2007, 2008, 2009 гг.), Диплома Россельхозакадемии за лучшие завершенные научные разработки 2010 года.

1.7. Публикации. Основные положения диссертационной работы опубликованы в 70 научных работах, в том числе в 14 статьях в изданиях по перечню, рекомендованному ВАК Минобрнауки России для публикации материалов докторских диссертаций. По результатам исследований получено 4 патента.

1.8. Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, включающих материалы и методы, результаты (4 главы), обсуждение, выводы и практические предложения, содержит 73 таблицы и 33 рисунка. Список литературы включает 486 источников. В приложении представлены таблицы исходных данных и копии документов, подтверждающих достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.

1.9. Личный вклад автора заключается в формулировании проблемы, постановке цели и задач исследований, методологическом обосновании путей решения поставленных задач, непосредственном планировании экспериментов и выполнении исследований, обобщении и интерпретации результатов, разработке нормативной документации. Автор принимала личное участие в изготовлении и контроле опытных серий препаратов, их испытаниях в птицехозяйстве, в подготовке научных публикаций и разработке методических документов.

1.10. Благодарности. Автор выражает благодарность научному консультанту, директору ВНИТИБП, академику РАСХН А.Я. Самуйленко. В выполнении некоторых разделов диссертации принимали участие и оказывали практическую и консультативную помощь сотрудники института Э.Ф. Токарик, Г.И. Воробьева, В.И. Еремец, Т.А.Скотникова, Н.К.Еремец, А.А. Нежута, А.И. Албулов, Е.П.Сапегина, Е.И.Школьников, М.А.Фролова, Ю.Д. Фролов, Т.А. Авдеева, Т.А.Ломакина, Л.А.Елисеева, С.В.Калугин, а также сотрудники ВГНКИ: В.И. Смоленский, О.А. Тугаринов; и ВНИТИП: В.И. Филоненко, В.Г. Шоль, И.П. Салеева, В.С.Лукашенко, Ш.А. Имангулов, Г.В. Игнатова - за что приносим им сердечную благодарность.

2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Работа выполнена в 1991-2011 гг. во ВНИТИБП и его опытном производстве. Часть исследований проводили совместно с сотрудниками ВГНКИ, ГосНиисинтезбелок, ГНУ ВНИТИП Россельхозакадемии, Института микробиологии РАН, кафедры микробиологии МГАВМиБ им. К. И. Скрябина, эффективность разработок испытывали в опытном хозяйстве ГУП «Загорское ЭПХ ВНИТИП».

Объектами исследований служили: штаммы-продуценты (лактобактерии Lactobacillus acidophilus, шт. 1К, ВКПМ №В-2991; бациллы Bacillus subtilis, шт. М-8, ВКПМ №B-1948; дрожжи Saccharomyces cerevisiae (diastaticus) ВКПМ-?-1218; новый штамм высшего гриба Fusarium sambucinum MKF 2001-3, ВКПМ №F-867; автолизат биомассы и культуральная жидкость гриба); новые препараты АВИЛАКТ-1К (жидкий или сухой пробиотик, содержащий живые клетки L. acidophilus, шт. 1К) и АВИСУБТИЛ (жидкий или сухой пробиотик, содержащий живые клетки B. subtili,s шт.М-8); пребиотик АВИСТИМ (культуральная жидкость гриба F.sambucinum шт. MKF 2001-3); белковая кормовая добавка ЦЕРЕВЕТ (сухая биомаса инактивированных клеток дрожжей S. cerevisiae diastaticus ВКПМ–?-1218); синбиотики АВИЛАКТ-ФОРТЕ (комплекс препаратов АВИЛАКТ-1K+АВИСТИМ) и ЛАКТОСУБТИЛ-ФОРТЕ (АВИЛАКТ-1K+АВИСУБТИЛ+ЦЕРЕВЕТ).

Для оценки безопасности препаратов определяли: токсичность для белых беспородных мышей (масса тела 12-14 г) после введения внутрибрюшинно препарата в широком интервале доз; токсичность для 9-10 сутчных SPF-эмбрионов кур (тест эмбриотоксичности); безвредность для цыплят суточного возраста после введения препаратов с кормом или водой; раздражающее действие на слизистые оболочки (ХЕТ-КАМ Тест в модификации).

Антагонистическую активность пробиотиков характеризовали в опытах: in vitro - по величине задержки роста полевых штаммов патогенных культур эшерихий (К-88, К-99, А-20E) и сальмонелл (S. tuphimurium, S. dublin, S. gallinarum); in vivo - по выживаемости цыплят при контрольном заражении полевым изолятом патогенного штамма E. сoli, выделенного в хозяйстве. Резистентность к антибиотикам определяли in vitro дисковым методом. Устойчивость бактерий-пробиотиков к действию желудочного сока (сухой медицинский, желудочный сок «Эквин». НПО «Биомед», г. Пермь) и желчи (желчь медицинская, ООО «Самсон», г.Санкт-Петербург) определяли по изменению количества живых бактерий после контакта с ними. Количество жизнеспособных бактерий определяли высевом на среды MRS-5 и сусло-агар.

Для характеристики химического состава пребиотика, кормовой добавки и зерноотходов определяли: массовую долю сухих веществ (по ГОСТ 28561-90); массовую долю золы (по ГОСТ 12572-67); массовую долю жира (по ГОСТ 13496.15-97); общий белок (по ГОСТ 26889-86); общее содержание углеводов (по ГОСТ 26176-91); макро- и микроэлементы методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии (на приборе ААS-1N); органические кислоты методом газо-жидкостной хроматографии (на хроматографе Хьюлетт - Паккард, колонка-полисорб); витамины (флюорометрическим методом по ГОСТ 29138-91, 19139-91, 29140-91); состав и содержание аминокислот (на аминокислотном анализаторе Биотроник LC-7000).

Антиоксидантную активность культуральной жидкости гриба определяли амперометрически на приборе «Яуза-ААА-01» (Яшин Я.И., Яшин А.Я., 2002).

Эффективность синбиотиков для цыплят-бройлеров (кроссов «Смена», «Конкурент-2», «Кобб – 500» и «Кобб – авиан-48») оценивали по зоотехническим показателям (масса и сохранность птицы, затраты корма); европейскому индексу продуктивности (ЕИП, определяемому по формуле ЕИП = АхВ/CхD, где А – живая масса, кг; В – сохранность, %; С – срок выращивания, сутки; D – затраты корма на 1 кг привеса, кг) и качеству мяса (выхода мясных частей, содержание в них белка и жира) с использованием соответствующих рекомендаций, разработанных ГНУ ВНИТИП. Влияние синбиотика на эффективность вакцинации птицы против НБ (вакцина против НБ птиц, штамм Ла-Сота, ТУ 10-19-212-86) оценивали по содержанию антител в сыворотке крови цыплят в реакции торможения гемагглютинации.

Экономическую эффективность синбиотиков рассчитывали по формуле:


загрузка...