Клинические и морфофункциональные особенности репаративной регенерации трофических язв нижних конечностей при их комплексном лечении с местным использованием милиацила и физических методов (26.07.2010)

Автор: Нузова Ольга Борисовна

26 больным основной группы, 21 пациенту первой контрольной группы, 20 – второй контрольной группы и 22 больным третьей контрольной группы выполнена предоперационная терапия. Из этих больных 17 пациентам основной группы, 14 – первой контрольной группы, 14 – второй контрольной группы и 15 – третьей контрольной группы произведена аутодермопластика. Причем, у 8 больных основной контрольной группы, 8 – первой контрольной группы, 7 – второй контрольной группы и 6 – третьей контрольной группы выполнена аутодермопластика и операция на венах. Операции на венах выполнялись после приживления аутотрансплантантов. У 9 пациентов основной группы, у 6 больных первой контрольной группы, 7 – второй контрольной группы и у 9 пациентов третьей контрольной группы произведена только аутодермопластика.

Из 26 оперированных больных основной группы 9 пациентам после заживления язв с помощью комплексного консервативного лечения выполнены операции на венах нижних конечностей. В первой контрольной группе из 21 оперированных больных 7 пациентам после заживления язв произведены операции на венах, во второй контрольной группе из 20 оперированных пациентов 6 больным выполнены операции на венах и из 22 оперированных больных третьей контрольной группы 7 пациентам также после заживления трофических язв комплексной консервативной терапией произведены хирургические вмешательства на венах. Операции на венах заключались в иссечении варикозно - расширенных поверхностных вен и разобщении поверхностной и глубокой систем.

У всех больных основной и контрольных групп при поступлении в стационар производили удаление патологически измененных тканей по окружности язвы и под ней. Ежедневно вокруг язвы обрабатывали кожу, удаляли рыхло лежащие гнойно – некротические ткани. Поверхность язвы обрабатывали 3 % раствором перекиси водорода.

У больных основной группы проводили ежедневно дистанционно сеанс магнитолазеротерапии. Для магнитолазеротерапии использовали аппарат магнитолазерного воздействия терапевтический «Изель – 2» с длиной волны излучения 0,85 мкм, плотностью мощности оптического излучения 20,4 мВт/см2. Магнитная индукция мтл: на рабочей поверхности не менее 40, на боковой поверхности не более 5. Продолжительность воздействия составляет 5 минут.

Лазеротерапия больным первой контрольной группы проводилась от полупроводникового инфракрасного лазера с длинной волны 0,8…0,88 мкм, общей мощностью излучения не менее 10 мВт, частотой 50 Гц от аппарата АМЛТ-10-01. Лазерное излучение проводилось дистанционно. Сеанс лазеротерапии был продолжительностью 3 минуты, проводился ежедневно. Курсовая нагрузка использования лучей лазера или магнитолазеротерапии 20 дней. Оценка результатов лечения больных основной и контрольных групп осуществлялась на основании изучения общего состояния пациентов и данных местного течения процесса.

Общее состояние больных исследовали с помощью таких показателей, как самочувствие, сон, аппетит, инструментально – лабораторных даных: общей термометрии, ЭКГ, клинических анализов крови и мочи, биохимических исследований крови (В.В. Меньшиков, 1973; В.Г. Колб, В.С. Камышников, 1976).

Местное течение патологического процесса контролировали по клиническим признакам – срокам исчезновения инфильтрации и гиперемии краев язвы, характеру и количеству раневого содержимого, срокам очищения язв от гнойно – некротического содержимого, срокам появления грануляций, краевой эпителизации и заживления. Измерение площади трофических язв (планиметрия) производили используя метод Л.Н. Поповой (М.И. Кузьмин, Б.М. Костюченок, 1981). Производилось ультразвуковое дуплексное ангиосканирование (эхосканер Diasonics Gateway – Fx).

У больных основной и контрольных групп выполнены исследования состава, микрофлоры трофических язв по общепринятой методике (Приказ МЗ СССР № 535 от 22.04.1985) перед началом лечения, на 7 день и по окончании лечения. Таким образом, устанавливалась видовая принадлежность выделенной флоры. Для оценки чувствительности микрофлоры к антибактериальным препаратам применяли метод бумажных дисков.

Морфологические исследования тканей язв проводились у больных основной и контрольных групп до лечения, на 3, 7, 14 день консервативного лечения. Забор материала для гистологических и гистохимических исследований производился под местной новокаиновой анестезией путем иссечения стерильным лезвием фрагмента из края и глубины трофической язвы.

Объекты изучены на светооптическом и электронно–микроскопическом уровнях. Гистосрезы толщиной 6 – 8 мкм, изготовленные на ротационном микротоме, после депарафинирования окрашены гематоксилином Майера и эозином, пикрофуксином по Ван Гизон, метиловым зеленым и пиронином по Браше, перйодатом К и реактивом Шиффа по Мак Манусу. Гистохимические реакции сопровождались соответствующими энзиматическими контролями (Э. Пирс, 1962). Для изучения ДНК – синтетической способности клеток проводились гистоавторадиографическме исследования биоптатов с использованием 3H тимидина. В связи с этим часть эксцизивных объектов мягких тканей инкубировали в среде 199 (1 час при t? +37? C) с добавлением 3H тимидина (молекулярная активность 1,96 ПБК/моль в дозе 3,75?105 БК на г. массы биоптата).

В последующем гистоавторадиографию проводили на парафиновых срезах толщиной 6 мкм по методике Л.Н. Жинкина (1959). Фотоэмульсию типа «р» экспонировали в течение двух месяцев. Гистоавтографы окрашивали гематоксилином и эозином. Меченными считались клетки, ядра которых содержали не менее 5 зерен восстановленного серебра. В соответствии с рекомендациями О.И. Епифановой, В.В. Терских, А.Ф. Захарова (1977) в автографах подсчитывали индекс меченых ядер (ИМЯ) в промилях на 5 – 7 тысяч клеток. Подсчет клеток, включающих радиоактивную метку, прежде всего осуществлялся относительно фибробластов. Это было обусловлено существенной их ролью в репаративных процессах (В.В. Рывняк, 1977; H. Struck, 1976; I.W. Green, R.P. Wenzel, 1977).

Для электронной микроскопии часть материала фиксировали в охлажденном 2,5 % растворе глутарового альдегида на S – коллединовом буфере (pH – 7,3). Постфиксацию проводили в четырехоксиде осмия (G. Milloning, 1961). Затем объекты дегидратировали в ацетоне с возрастающей концентрацией и заключали в смолу ЭПОН – 812 и Аралдит. Ультратонкие срезы, изготовленные на ультратоме LKB – 5 (Sweden, Bromma), подвергали двойному контрастированию в 5 % спиртовом растворе уранил – ацетата и цитрате свинца (E.S. Reynolds, 1963). В последующем срезы изучали и фотографировали в электронном микроскопе ЭВМ 100 АК при увеличениях от х12000 до 50000.

Электронно – микроскопическая гистоавторадиография выполнена по методике F. Larra et B. Droz (1970). При этом ультратонкие срезы наносились на коллодиевую пленку специально приготовленных предметных стекол. Дополнительное контрастирование осуществлялось в 5% спиртовом растворе уранил – ацетата. В последующем проводили контрастирование срезов цитратом свинца. После вакуумного напыления стекол со срезами углем наносили фотоэмульсию типа «М» (НИИ ХИМФОТО). Ультраструктурные радиографы после 1,5 – 2 месяцев экспозиции проявляли в соответствующем растворе амидола и затем просматривали в электронном микроскопе.

Для идентификации клеток с экспрессией проапоптотического белка р53 и для выявления интрануклеосомальной фрагментации ДНК, кусочки ткани трофических язв фиксировали 10 % нейтральным формалином, обезвоживали и заливали в парафин. Исследование проводили на серийных парафиновых срезах толщиной 5 – 6 мкм.

Срезы инкубировали с моноклональными антителами к р53 (фирма «Dako», Дания) в рабочем разведении 1:50. Для выявления иммунного окрашивания использовали стрептавидинбиотиновый пероксиазный метод (Dako LSAB – kit, Дания), затем осуществляли докрашивание ядер водным раствором гематоксилина. С целью определения внутриядерной фрагментации ДНК использовали набор реактивов «Apoptag Plus in Situ Apoptosis Detection Kit» (фирма «Intergen», Канада), докрашивание ядер производили 0,5 % раствором метиленового зеленого на 0,1 М ацетатном буфере. При постановке Apoptag – теста ядерный хроматин клеток, вступивших в апоптоз, приобретал коричневое окрашивание.Идентификация аптиапоптотического протеина bcl-2 осуществляли иммуноцитохимически с использованием моноклональных антител(фирма “Дако”, Дания).

Экспериментальные исследования проведены на 54 белых беспородных крысах обоего пола, массой 260 – 330 г. У крыс смоделирован раневой процесс задних конечностей. Подопытным крысам после удаления волосяного покрова и обработки кожи настойкой йода и спиртом внутримышечно в область бедра вводили 1 мл взвеси суточной культуры стафилококка (2 млрд микробных тел) и 0,25 мл 0,25% раствора сульфата магния. 27 животным инфицирование производили ведением St. aureus с антилактофериновой активностью (АЛФА +) и 27 животных – микробным штаммом стафилококка без аналогичной активности (АЛФА -) . После получения через 5 – 7 дней модели гнойно – воспалительного очага производили его хирургическую обработку. Оперативное вмешательство проводили под местной новокаиновой анестезией. Далее у крыс основной серии в местном лечении гнойных ран использовали ежедневно магнитолазеротерапию, затем на рану наносилось 0,3 мл милиацила, накладывалась марлевая повязка.

В первой контрольной серии экспериментов исследовали характер течения гнойно – воспалительного процесса без лечебной коррекции. Во второй контрольной серии лечение гнойных ран осуществлялось только милиацилом. Он наносился также ежедневно по 0,3 мл, делалась повязка. В каждой серии экспериментов взято по 18 крыс (9 крыс инфицированы St. aureus АЛФА + и 9 крыс инфицированы St. aureus АЛФА –).

В процессе исследования проведены клинические наблюдения за животными, выполнены гистологические и гистоавторадиографические исследования тканей из края раны на 3, 7 и 14 день лечения после забоя крыс. Кроме того, изучены морфо – функциональные изменения в гипоталамо - гипофизарной нейросекреторной системе (ГГНС) у животных всех трех серий опытов, в указанные выше сроки. Исследованы тканевые структуры гипоталамуса, гипофиза. В указанные сроки забивали по 6 крыс каждой серии (по 3 крысы, инфицированные St. aureus АЛФА + и 3 крысы - St. aureus АЛФА –) для проведения морфологических исследований. Крыс умерщвляли путем декапитации под гексеналовым внутрибрюшинным наркозом(35-40мг/кг). Объекты исследованы на светооптическом и электронномикроскопическом уровнях. Эксперименты выполнялись с соблюдением принципов гуманности, изложенных в дериктивах Европейского сообщества(86/609/ЕЕС) и Хельсинской декларации по защите позвоночных животных, используемых для лабораторных и иных целей.

Полученные в ходе исследования данные обработаны с использованием параметрических методов вариационной статистики, в соответствии рекомендациям Е.В. Гублера, А.А. Генкина (1973).. Статистическую обработку данных проводили на IВМ РС AТ Рentium 4 в среде Windows ХР с использованием пакета программ Microsoft Excel версии 9,0.Определяли средние выборочные показатели измеряемых объектов, ошибку среднего, среднее квадратичное отклонение, доверительный интервал. За достоверность различий принимали значение р<0,05(по t-критерию Стьюдента), вероятность различий составляла 95% и более.

Результаты исследований и их обсуждение

Материалы проведенных клинических исследований 334 больных с трофическими язвами нижних конечностей различного генеза свидетельствуют о том, что наиболее эффективным оказалось использование милиацила и магнитолазеротерапии в комплексном консервативном лечении, чем применение милиацила и лазерного излучения, только милиацила или 1% раствора диоксидина и облепихового масла (табл. 2, рис. 1).

Использование милиацила и магнитолазеротерапии у больных основной группы приводило на 3 сутки лечения к значительному уменьшению гнойно – некротического содержимого язв, появлению сочных, зернистых, ярко – красных грануляций. При этом улучшалось общее состояние пациентов. На 7 сутки лечения содержимое язв было скудным, серозным, хорошо выявлялась краевая эпителизация. К 10 суткам трофические язвы у большинства пациентов заживали.

У больных первой контрольной группы на 3 день лечения милиацилом и лазерным излучением наблюдалось выраженное уменьшение гнойно – некротического содержимого язв, появление розовых грануляций. На 7 сутки комплексного консервативного лечения содержимое язв было серозным, в незначительном количестве. Язвы заполнялись зернистыми, ярко-красной окраски грануляциями. К 10 дню лечения язвы значительно уменьшались в размерах, отмечалась краевая эпителизация. К 15 дню у большинства пациентов трофические язвы заживали.

У второй контрольной группы при местном лечении трофических язв милиацилом происходили сходные с таковыми в первой контрольной группе изменения, но протекали они медленнее. К 21 дню у большинства больных этой группы наблюдалось полное заживление трофических язв.

У больных третьей контрольной группы на 3 день лечения язв 1% раствором диоксидина отличалось лишь незначительное уменьшение гнойного их содержимого. На 7 сутки лечения содержимое трофических язв оставалось прежнего характера, но в несколько меньшем количестве. К 14 дню лечения выявлялась слабая краевая эпителизация, язвы заполнялись грануляциями розового цвета, шел на убыль перифокальный воспалительный процесс. На 28 день лечения на поверхности язв сохранялись небольшие участки, содержащие гнойно-некротические массы. В среднем длительность заживления трофических язв в этой контрольной группе (при лечении язв 1% раствором диоксидина и далее облепиховым маслом) составляла 32 дня.

Таблица 2

Результаты лечения трофических язв в зависимости от способа лечения (M±m)

Способы лечения Сроки в днях

Очищение Появление грануляций Начало эпителизации койко-день

Милиацил и магнитолазеротерапия 2,5 ± 0,1 2,3 ± 0,1 4,7 ± 0,1 12,6 ± 0,5

Милиацил и лазерное излучение 3,0 ± 0,1* 2,7 ± 0,1* 6,0 ± 0,2* 15,6± 0,5*

Милиацил 5,0 ± 0,2* 4,5 ± 0,2* 8,3 ± 0,2* 20,8 ± 1,4*

Облепиховое масло, диоксидин 8,8 ± 0,3* 8,3 ± 0,2* 13,1 ± 1,3* 32,6 ± 1,3*

Примечание: * - показатели, достоверно отличающиеся от таковых при применении милиацила и магнитолазеротерапии (p<0,05).

Рисунок 1 Сравнительные результаты лечения трофических язв у больных основной и контрольных групп.

Приведенные данные, свидетельствуют о том, что по указанным показателям раневой процесс протекал более благоприятно у больных при сочетанном местном использовании милиацила и магнитолазеротерапии.

В среднем сроки лечения трофических язв нижних конечностей меньше у больных основной группы в 1,2 раза, чем у пациентов первой контрольной группы и соответственно в 1,6 и 2,5 раза, чем у больных второй и третьей контрольных групп.

О преимущественном воздействии милиацила и магнитолазеротерапии свидетельствуют и проведенные в динамике исследования площади заживления трофических язв (табл.3).

При сочетанном местном применении милиацила и магнитолазеротерапии полное заживление трофических язв выявлено у 92 (95,8%) из 96 больных, а частичное у 4 (4,2). Использованием милиацила и лазерного излучения полное заживление язв достигнуто у 55 (91,6%) из 60 больных, а частичное у 5 (8,4 %). При применении только милиацила из 59 больных полное заживление трофических язв выявлено у 51 (86,4 %) пациента, частичное у 8 (13,6 %). Местным лечением язв 1 % раствором диоксидина и облепиховым маслом достигнуто полное их заживление у 18 (60 %) из 30 больных и частичное – у 12 (40 %).

Использование милиацила и магнитолазеротерапии в лечении трофических язв позволяет также успешно применять аутодермопластику, операции на венах и нижних конечностей (табл. 4).


загрузка...