Идиотип-антиидиотипические взаимодействия как механизм индукции и развития аутоиммунных реакций (26.01.2009)

Автор: Бедулева Любовь Викторовна

3. Механизм индукции аутоантител к коллагену II типа в модели коллаген-индуцированного артрита крыс. Регуляторная роль ревматоидного фактора

Сыворотка, реагирующая с бычьим коллагеном и крысиным коллагеном (аутоколлагеном), полученная от артритных и устойчивых крыс в модели КИА была проинкубирована на коллагене быка и коллагене крыс, сорбированных на пластике. Результаты определения уровня антител к крысиному коллагену (аутоантител) и антител к бычьему коллагену до и после инкубации сыворотки на коллагене крыс представлены на рисунке 9А, после инкубации на коллагене быка - на рисунке 9Б.

Рисунок 9 - Титр антител к бычьему коллагену и аутоантител к коллагену до и после истощения сыворотки на крысином коллагене (А) и на бычьем коллагене (Б).

Примечание: Результаты представлены в виде: (среднее±SD), (p<0,05), n=8.

После инкубации сывороток (рисунок 9А) на крысином коллагене уровень антител к бычьему коллагену не изменялся по сравнению с исходным, тогда как аутоантитела к коллагену истощались. После инкубации исследуемых сывороток на коллагене быка уровень аутоантител к коллагену снижался, также как и уровень антител к бычьему коллагену (рисунок 9Б). Однако, снижение уровня аутоантител к коллагену по отношению к исходному уровню было недостоверно (p=0,1). Индивидуальный анализ результатов показал, что в 2 из 8 исследованных сывороток снижение уровня аутоантител к коллагену после инкубации сывороток на коллагене быка не наблюдалось.

Факт, что антитела к бычьему коллагену не истощаются на коллагене крыс, свидетельствует в пользу того, что антитела к бычьему коллагену и аутоантитела к коллагену – не одни и те же антитела, перекрестно-реагирующие с бычьим и крысиным коллагеном. Антител к бычьему коллагену и аутоантитела к коллагену – продукты разных клонов лимфоцитов. На это указывает также характер кинетики антител к бычьему коллагену и аутоантител к коллагену (рисунок 5). Кинетика аутоантител к коллагену не совпадает с кинетикой антител к бычьему коллагену (рисунок 5).

Выявленное снижение уровня аутоантител к коллагену в некоторых образцах сывороток при инкубации их на коллагене быка позволяет предполагать наличие перекрестной реактивности у антиколлагеновых аутоантител с гетерологичным коллагеном. Однако, наличие перекрестной реактивности аутоантител к коллагену с бычьим коллагеном в некоторых случаях в условиях in vitro не является доказательством того, что бычий коллаген может непосредственно активировать аутореактивные антиколлагеновые лимфоциты in vivo и вызывать артрит. Также нельзя объяснить активацию продукции аутоантител к коллагену бычьим коллагеном в тех отдельных случаях (2 из 8 исследованных сывороток), когда перекрестная реактивность аутоантител к коллагену с БК не была выявлена.

Рисунок 10 - Специфическое связывание (ОП реакции) антисывороток, содержащих аутоантитела к коллагену крыс с крысиным коллагеном (n=12) в присутствие сывороток, содержащих ревматоидный фактор (n=12) и интактной пулированной сыворотки крыс.

Примечание: (Среднее±SE). Антиcыворотки, содержащие аутоантитела к коллагену крыс, были предварительно истощены от антител к бычьему коллагену.

* - достоверно по отношению к контролю 1, 2.

Между аутоантителами к коллагену и ревматоидным фактором было исследовано наличие ИАИ взаимодействий методом конкурентного ИФА по способности РФ-содержащей сыворотки, полученной на 7 день после иммунизации бычьим коллагеном, ингибировать связывание аутоантител к коллагену с коллагеном крыс. Результаты исследования специфической реакции анти-КК/КК в присутствие сыворотки, содержащей ревматоидный фактор, представлены на рисунке 10. ОП специфической реакции связывания анти-КК с КК в присутствие РФ-содержащей сыворотки, был достоверно ниже (p?0,01), чем в контроле, где вместо РФ-содержащей сыворотки был добавлен ЗФР. Таким образом, ревматоидный фактор конкурирует с коллагеном крыс за связывание с аутоантителами к коллагену крыс и, следовательно, вступает в идиотип-антиидиотипические взаимодействия не только с антителам, специфичным к бычьему коллагену, но и с аутоантителами, специфичными к крысиному коллагену.

Полученные данные указывают на следующий характер взаимодействий между лимфоцитами, специфичными к бычьему коллагену, лимфоцитами специфичными к крысиному коллагену и РФ-продуцирующими лимфоцитами (рисунок 11).

В соответствии с этой схемой аутореактивные лимфоциты, специфичные к собственному коллагену, активируются не бычьим коллагеном, как предполагается в соответствии с гипотезой молекулярной мимикрии, а опосредованно через цепочку связанных в ИАИ взаимодействиях лимфоцитов.

Рисунок 11 – Гипотетическая схема организации фрагмента иммунной сети, объясняющая механизм повышения уровня ревматоидного фактора и аутоантител к коллагену при введении БК.

Примечание: БК - бычий коллаген, КК – крысиный коллаген.

Идиотип-антиидиотипические взаимодействия не только передают информацию, но и на их основе формируются механизмы регуляции активности клонов лимфоцитов, включая аутоклоны. Точка зрения на то, что ревматоидный фактор представляет собой антиидиотипические антитела по отношению к антиколлагеновым аутоантителам, позволяет предполагать, что ревматоидный фактор и лимфоциты его продуцирующие вовлечены в регуляцию активности антиколлагеновых лимфоцитов через ИАИ взаимодействия. Это не противоречит современным знаниям о функциях антиидиотипических антител и лимфоцитов. Антиидиотипические антитела и лимфоциты, реактивные к идиотипам аутоантител или аутореактивных Т-лимфоцитов, способны подавлять образование антител, несущих этот идиотип, и поэтому способны поддерживать состояние специфической толерантности (Zanetti M., 1991, Routsias J., 2002, Kohler H., 1989). Наличие контроля над аутореактивными антиколлагеновыми лимфоцитами со стороны РФ-продуцирующих лимфоцитов делает принципиально невозможной прямую активацию аутореактивных антиколлагеновых лимфоцитов гетерологичным коллагеном, как предполагает гипотеза молекулярной мимикрии, так как такая активация не затрагивает РФ-продуцируюшие лимфоциты, а, следовательно, механизмы контроля аутореактивных антиколлагеновых лимфоцитов. Активация аутореактивных антиколлагеновых лимфоцитов бычьим коллагеном опосредованно через цепь ИАИ взаимодействий в соответствии со схемой на рисунке 11 в первую очередь вызывает активацию РФ-продуцирующих лимфоцитов, т.е. вмешивается в механизмы регуляции антиколлагеновых аутоклонов и поэтому может приводить к индукции аутоиммунной реакции к коллагену в модели коллаген-индуцированного артрита крыс.

Таким образом, в ответ на иммунизацию бычьим коллагеном аутоантитела к коллагену образуются как анти-анти-идиотипические по отношению к лимфоцитам, специфичным к бычьему коллагену. Лимфоциты, продуцирующие ревматоидный фактор, являются «проводником» активационного сигнала через идиотип-антиидиотипические взаимодействия от лимфоцитов, специфичных к бычьему коллагену, к лимфоцитам, специфичным к аутоколлагену.

4. Сравнительный анализ кинетики антител к бычьему коллагену, аутоантител к коллагену, ревматоидного фактора у устойчивых и артритных крыс

Сравнительный анализ кинетики антител к бычьему коллагену, аутоантител к коллагену, ревматоидного фактора у устойчивых и артритных крыс в период предшествующий клиническим проявлениям артрита показывает, что кинетика исследуемых антител у устойчивых и артритных крыс принципиально различна (рисунок 12). В этот период не выявляются циркулирующие иммунные комплексы, поэтому уровень антител, определяемых в крови, может отражать их истинную продукцию лимфоцитами. На рисунках 12 Б и 12 Г показано, что у устойчивых к артриту крыс в ответ на иммунизацию бычьим коллагеном ревматоидный фактор прогрессивно нарастет в течение 14 дней. При этом уровень антител к бычьему коллагену и аутоантител к коллагену остается на очень низком уровне. Латентный период в образовании антиколлагеновых антител на фоне высокого уровня ревматоидного фактора у устойчивых животных может является проявлением регуляторного (супрессорного) влияния ревматоидного фактора в отношении антиколлагеновых лимфоцитов.

У артритных крыс в ответ на иммунизацию бычьим коллагеном уровень ревматоидного фактора повышается незначительно и резко падает через 7 дней после введения бычьего коллагена. Падение уровня ревматоидного фактора сопровождается резким увеличением уровня антител к бычьему коллагену и аутоантител к коллагену на 14 день (рисунок 12А, рисунок 12В).

Рисунок 12 - Кинетика антител к бычьему коллагену, аутоантител к коллагену, ревматоидного фактора у крыс с артритом в период предшествующий артриту и у устойчивых крыс в аналогичный промежуток времени.

Примечание: 0 – день введения бычьего коллагена. А – кинетика антител у крыс с артритом в 1-ой экспериментальной серии, каждая точка – среднее 4-х исследований ± SE; Б - кинетика антител у устойчивых крыс в 1-ой экспериментальной серии, каждая точка – среднее 10 исследований; В - кинетика антител у крыс с артритом во 2-ой экспериментальной серии, каждая точка – среднее 5 исследований ± SE; Г - кинетика антител у устойчивых крыс во 2-ой экспериментальной серии, каждая точка – среднее 9 исследований;

У артритных животных уровень ревматоидного фактора на 7 день после введения бычьего коллагена достоверно ниже (p<0,05), чем у устойчивых крыс (рисунок 13)

Рисунок 13 – Уровень ревматоидного фактора на 7 день после иммунизации бычьим коллагеном в крови крыс с артритом (n= 12) и оказавшихся устойчивыми (n= 12).

Примечание: (среднее±SE,), p?0,05.

Из полученных фактов следует, что развитие артрита в модели КИА связано со слабой и непродолжительной продукцией ревматоидного фактора в преартритный период, сопровождающейся ростом антиколлагеновых антител. Тогда как значительный и продолжительный рост ревматоидного фактора и слабая продукция антиколлагеновых антител в ответ на иммунизацию бычьим коллагеном были ассоциированы с устойчивостью к артриту в модели КИА.

., 1989). У крыс (рисунок 12А и 12В), у которых разовьется артрит, между 1-ой и 2-ой неделей после введения бычьего коллагена наблюдался одновременно относительно высокий уровень ревматоидного фактора и аутоантител к коллагену в крови, а на 2-ой неделе определялся максимальный уровень ЦИК, тогда как у устойчивых крыс высокий уровень антиколлагеновых антител и ревматоидного фактора в крови во времени не совпадали (рисунок 12Б, 12Г) и ЦИК не выявлялись. Одновременно высокая активность идиотипических и антиидиотипических лимфоцитов, какими являются лимфоциты, продуцирующие ревматоидный фактор и аутореактивные лимфоциты к коллагену соответственно, не типична для нормального ответа идиотипических и антиидиотипических лимфоцитов. В норме ИАИ взаимодействия устроены так, что идиотип подавляет образование антиидиотипа, а антиидиотип подавляет продукцию идиотипа, что снимает внутренний конфликт одновременного синтеза значительных количеств взаимодействующих друг с другом идиотипических и антиидиотипических антител, который может привести к образованию из них иммунных комплексов и к иммуннокомплексным заболеваниям (Пол У., 1986). Поэтому в качестве гипотезы можно принять, что в результате слабой продукции ревматоидного фактора и недостаточной регуляторной активности ревматоидного фактора в отношении аутореактивных антиколлагеновых лимфоцитов повышение уровня аутоантител к коллагену и ревматоидного фактора в крови происходит одновременно. Это приводит к формированию из аутоантител к коллагену и ревматоидного фактора циркулирующих иммунных комплексов. В свою очередь уход ревматоидного фактора в ЦИК может усугублять ситуацию слабой продукции ревматоидного фактора. Слабый ответ ревматоидного фактора в ответ на иммунизацию бычьим коллагеном и уход ревматоидного фактора в ЦИК вместе могут обеспечивать длительное поддержание дисрегуляции во идиотип-антиидиотипических взаимодействиях между РФ-продуцирующими лимфоцитами и антиколлагеновыми лимфоцитами с постоянным производством циркулирующих иммунных комплексов. Эти результаты позволяют рассматривать лимфоциты, продуцирующие ревматоидный фактор, как мишени для разработки новых средств терапии.

5. Исследование аутоиммунной реакции в математической модели идиотип-антиидиотипических взаимодействий лимфоцитов

Как в модели аутоиммунной гемолитической анемии у мышей, так и в модели коллаген-индуцированного артрита крыс выявлена особенность кинетики аутоантител, заключающаяся в том, что появление аутоантител опережает рост уровня антител на чужеродный антиген, которым были иммунизированы животные с целью индукции аутоиммунных реакций. С помощью различных методических подходов в настоящем исследовании установлено, что аутоантитела в модели АГА и аутоантитела (ревматоидный фактор) в модели КИА являются антиидиотипическими по отношению к антителам на чужеродный антиген, введение которого инициирует аутоиммунный процесс в данных моделях. Факт раннего появления аутоантител, если их индукция осуществляется опосредовано через идиотип-антиидиотипические взаимодействия с лимфоцитами против чужеродного антигена, является новым, ранее не описанным. Принято считать, что сначала появляются идиотипические антитела - антитела, специфичные к иммуногену, за которыми далее следует спонтанный ответ антиидиотипических, которые могут быть аутоантителами.

Однако, как показало настоящее исследование, правило, что продукция антиидиотипических антител следует за продукцией идиотипических, не выполняется в экспериментальных моделях коллаген-индуцированного артрита крыс и аутоиммунной гемолитической анемии у мышей, где антиидиотипическими антителами являются аутоантитела. Экспериментальные условия этих моделй были исследованы в математической модели идиотип-антиидиотипических взаимодействий (Меньшиков И.В., 2004).

В иммунной сети в паре лимфоцитов, связанных в идиотип-антиидиотипических взаимодействиях, один из клонов был обозначен как аутореактивный, другой как клон, реагирующий на внешний антиген. Исходное состояние сети было установлено как состояние толерантности к постоянно присутствующему аутоантигену (рисунок 14), что нашло отражение в более низком значении активности соответствующих клонов, по сравнению с состоянием активности клонов до введения аутоантигена.

Рисунок 14 - Теоретическая кинетика антиидиотипических (аутореактивных) и идиотипических клонов лимфоцитов при введении гетерологичного антигена.

Примечание: Ведение чужеродного антигена показано стрелкой. Представлены активности клонов в условных единицах.

Последующее введение антигена взаимодействующего с лимфоцитом, антиидиотипическим по отношению к аутоклону, вызывает транзиторную аутоиммунную реакцию, что проявилось ростом активности аутоклонов (рисунок 14). Особенностью динамики аутоиммунной реакции (рисунок 14), вызванной через идиотип-антиидиотипические взаимодействия, является то, что аутореактивный клон, являясь антиидиотипическим, отвечает раньше, чем клон, реагирующий на вводимый антиген. Сопоставление полученной теоретической кинетики идиотипических антител (антител на чужое) и антиидиотипических (аутоантител) с кинетикой антител на эритроциты крыс и аутоантител к эритроцитам в модели АГА (рисунок 1) и кинетикой антител к бычьему коллагену и ревматоидного фактора в модели КИА (рисунок 5, 6) указывает на их сходство.

Ранняя продукция аутоантител может быть проявлением предсуществующей асимметрии в идиотип-антиидиотипических взаимодействиях между аутореактивным клоном и клоном, реагирующим на чужое. Сущность асимметрии заключается в том, что аутореактивные клоны постоянно испытывают активирующий сигнал со стороны присутствующего в организме аутоантигена, в отличие от связанных с ними антиидиотипических лимфоцитов на чужое, не испытывающих постоянной нагрузки со стороны внешнего антигена. Именно такая асимметрия, как условие, была задана в математической модели введением аутоантигена. Однако активность аутореактивных лимфоцитов находится постоянно под супрессорным контролем антиидиотипических лимфоцитов на чужое. Иммунизация антигеном отвлекает на себя активность контролирующих лимфоцитов, что немедленно приводит к проявлению активности аутореактивных лимфоцитов. Проявленная активность аутореактивных клонов сдерживает активность идиотипположительных лимфоцитов – лимфоцитов, специфичных к чужеродному антигену, что проявляется в виде запаздывания иммунного ответа на чужеродный антиген.

Более того, выявленный факт раннего появления аутоантител, опережающего образование антител на введенный антиген, указывает на то, что аутоантитела образуются не в результате запуска каскада идиотип-антиидиотипических реакций, как предполагается в работах Shoenfeld Y, 1994, Wun H., 2001. К повышению уровня аутоантител приводит временное снижение активности антиидиотипических лимфоцитов, контролирующих активность аутореактивных лимфоцитов. Таким образом, иммунный ответ аутореактивных лимфоцитов, опережающий иммунный ответ на чужеродный инициирующий антиген, выявленный в двух экспериментальных моделях – модели АГА у мышей, и модели КИА крыс, а также при моделировании аутоиммунной реакции в математической модели иммунной сети, может являться общей особенностью реакции аутореактивных лимфоцитов при их активации через идиотип-антиидиотипические взаимодействия с лимфоцитами на чужое.

В экспериментальной модели аутоиммунной гемолитической анемии у мышей, вызванной введением эритроцитов крыс, максимумы образования антител к эритроцитам крыс и антиэритроцитарных аутоантител не совпадают во времени. Данный факт указывает на то, что аутоантитела к эритроцитам и антитела к эритроцитам крыс являются продуктами разных клонов лимфоцитов.

Между антителами к эритроцитам крыс и аутоантителами к эритроцитам мышей существуют идиотип-антиидиотипические взаимодействия, выявленные по наличию конкуренции между эритроцитами крыс и аутоантителами к эритроцитам мышей за связывание с антителами к эритроцитам крыс.

Принадлежность антиэритроцитарных аутоантител и антител против эритроцитов крыс к разным клонам лимфоцитов, существование идиотип-антиидиотипических взаимодействия между ними подтверждают гипотезу о том, что механизмом развития аутоиммунной гемолитической анемии у мышей является идиотип-антиидиотип опосредованная активация аутореактивных антиэритроцитарных лимфоцитов.

Независимый характер кинетики аутоантител к коллагену от кинетики антител к бычьему коллагену в модели коллаген-индуцированного артрита крыс, вызванного введением бычьего коллагена, а также отсутствие взаимодействия между антителами к бычьему коллагену и коллагеном крыс доказывают, что антитела к бычьему коллагену и аутоантитела к коллагену крыс являются продуктами разных клонов лимфоцитов.


загрузка...