Разработка генодиагностики комплекса аномалий позвоночника [CVM] и иммунодефицита [BLAD] у животных черно-пестрого голштинизированного скота (25.09.2012)

Автор: Марзанова Саида Нурбиевна

- Генетико-генеалогический анализ выдающихся быков-производителей-носителей мутантных CV и BL аллелей.

- Распространение миссенс-мутаций CV и BL среди высокопродуктивных коров.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводили с 2009 по 2012 годы на кафедре иммунологии ФГБОУ ВПО МГАВМиБ и ЗАО «Синтол» по схеме, представленной на рис.1. ДНК выделяли из семени быков и крови коров с помощью фенольно-хлороформного и сорбентного (ДНК-сорб-В, ООО «ИнтерЛабСервис») методов. Выделенную ДНК исследовали по аллелям двух наследственных заболеваний: комплекса аномалий позвоночника [CVM] и дефицита лейкоцитарной адгезии [BLAD]. Диагностику мутантного BL аллеля, вызывающую дефицит лейкоцитарной адгезии или BLAD осуществляли по методике, изложенной в работах Shuster D.E. et al. [1992] и Tammen I. [1994]. В качестве праймеров для диагностики мутантного BL аллеля использовали следующие последовательности:

BLAD forward: 5’ – GTC AGG CAG TTG GGT TCA – 3’

BLAD reverse: 5’ – GAG GTC ATC CAC CAT CGA GT – 3’.

Что касается диагностики мутантного CV аллеля комплекса аномалий позвоночника [CVM], то она осуществлялась по методу, описанному Rusc A., Kaminski S. [2007]. В качестве праймеров использовали следующие последовательности:

CVM forward: 5’ – TCA GTG GCC CTC AGA TTC TC – 3’

CVM reverse: 5’ – CCA AGT TGA ATG TTT CTT ATC CA – 3’.

Исследовали быков-производителей (n=474) и быковоспроизводящих групп коров (n=127) черно-пестрой породы с разной кровностью по голштинской черно-пестрой породе. Аттестация быков и коров на носительство мутантных CV и BL аллелей. Определение частоты встречаемости аллелей и генотипов в локусах SLC 35A3 и CD 18, оценка генетического равновесия по локусам двух наследственных болезней. Генетико-генеалогический анализ происхождения быков, носителей мутантных CV и BL аллелей. Геногеографический анализ носительства CV и BL в Российской Федерации и за рубежом

Рис. 1. Общая схема исследований

Разработку методики ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) для одновременной диагностики CV и BL проводили на приборе Rotor Gene Q (Corbett Research, Австралия). Изучали генетические параметры: частоты встречаемости аллелей, генотипов, наличие генетического равновесия в изучаемых локусах методом ?2.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Сравнительный анализ методов выделения ДНК из различных материалов. Проведённый сравнительный анализ различных методов выделения ДНК показал, что каждый метод имеет как свои преимущества, так и свои недостатки. Фенольно-хлороформовый метод позволяет выделять высоко очищенную ДНК хорошего качества, однако требует больших затрат времени, а также использования вредного для здоровья реагента фенола. Тем не менее, получаемая таким способом ДНК высокого качества и она может храниться длительное время. Данный метод хорош при создании Банков ДНК, требующих их длительного хранения.

Оптимальным для нашей работы является сорбентный метод выделения ДНК (ДНК-сорб-В, ООО «ИнтерЛабСервис»). Он обладает технической простотой и позволяет экономить время, не прибегая к трудоемкой процедуре фенольной экстракции. Однако качество и стабильность препаратов в целом заметно ниже, чем фенольно-хлороформных экстрактов. Сорбентный метод удобен в том случае, если препарат выделенной ДНК не нужно хранить долгие годы. Очищенную ДНК можно хранить в течение одной недели при температуре от 2 до 8°С в обычном бытовом холодильнике, в течение года при температуре не выше минус 16°С. Поэтому для дальнейшей работы был выбран сорбентный метод для выделения ДНК.

Диагностика миссенс-мутаций CV и BL у крупного рогатого скота методом ПЦР-РВ. Исследованиями на CV и BL мутаций был охвачен 601 образец семени и крови, из них 474 - от быков и 127 от коров. ПЦР-РВ проводили на приборе Rotor Gene Q [Corbett Research, Австралия]. Использовали программу термоциклирования, приведенную в табл. 1. В табл.1 представлены стадии проведения ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). Удержание дает команду прибору оставаться при определенной температуре в течение заданного времени (180 сек., повтор 1).

Табл. 1. Характеристика параметров термоциклирования для диагностики мутантных аллелей, вызывающих комплексную аномалию позвоночника (CVM) и дефицит лейкоцитарной адгезии (BLAD)

Шаги Температура, 0С Время, сек Детекции Повторы

Удерживание температуры 94 180 Нет 1

Циклирование 1 94 20 Нет 10

61 20 Нет

64 30 Нет

Циклирование 2 94 20 Нет 30

61 20 Нет

64 30 по каналам: Green, Yellow, Orange, Red

В процессе циклирования происходит денатурация, отжиг праймеров и синтез новой цепи ДНК. При циклировании 1 повторов 10, они не детектируются, так как данные не репрезентативны. При циклировании 2 - повторов 30, в результате получаемые данные стабильные и являются окончательными в плане диагностики. Реакционная смесь имела следующий состав: 50 мМ KCl, 50 мM TRIS-HCl, 250 нМ dNTP, 2,5 мМ MgCl2, 2,5 ед. ДНК-полимеразы Syntaq. Праймеры использовали в концентрации 200 нМ, флуоресцентные зонды – в концентрации 100нМ.

Следующим этапом являлась разработка системы для выявления мутантных аллелей методом ПЦР-РВ. Мы применили аллельспецифические зонды для детекции BL и CV мутаций. Для локуса с мутацией подбирали пару зондов, так чтобы один из них специфически гибридизовался при температуре проведения синтеза цепей с аллелем нормального типа, а второй зонд – с аллелем мутантного типа. Эти зонды метили разными флуорофорами, а результаты реакции с ними регистрировали на двух различных каналах детекции прибора для ПЦР-РВ. Для определения CT и CV аллелей мы использовали 2 канала – Green и Yellow. Нормальный CT аллель дает рост сигнала по каналу Green, детектируемый флуорофором FAM, а мутантный аллель CV - по каналу Yellow, меченный флуорофором R6G. Что касается TL и BL аллелей, то для их определения использовали тоже 2 канала, только Orange и Red. Нормальный TL аллель дает рост сигнала по каналу Orange, детектируемый флуорофором FAM, а мутантный аллель BL - по каналу Red, меченый флуорофором Cy5.

Результаты интерпретируются на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линии. Переход порога, это характеристика количества копий ДНК отдельного гена. При оптимальном количестве копий ДНК, кривая располагается между двумя пороговыми значениями 10 и 15 циклами амплификации. При перемещении кривой влево по оси абсцисс, это говорит о высокой концентрации ДНК, если вправо, то недостатке ее концентрации в реакции. Все образцы, графики флуоресценции которых, превышают или пересекают эту линию порога, будут считаться положительными по определенному каналу, т.е. содержащими соответствующий каналу флуоресценции аллель. Эффективность ПЦР-РВ была выше в 2 раза, чем классические методы ПЦР, которые использовались ранее в работе.

Qпроведен анализ семени быка Пломбира 998. Пломбир 998 принадлежал ОАО «Смоленское» по племенной работе. Он был широко использован среди черно-пестрого скота Смоленской области, а в последующем Кабардино-Балкарии и Ингушетии. Несмотря на его известную родословную и отсутствие анализа на BLAD и CVM, семя быка интенсивно использовалось в 3-х регионах России. Его отцом был Пионер 188. Пионер 188 являлся сыном Карлин М. Айвенго Белла 1667366, который передал своему потомку оба наследственных заболевания, а он в свою очередь Пломбиру 998. Это редкий случай, когда бык передавал своему потомству сразу два мутантных CV и BL аллеля.

На рис. 2 приводим генетическую генеалогию быков, потомков Карлин М. Айвенго Белла 1667366, которые получили от своего предка CV аллель.

Проведенный анализ показал, что отечественные быки Голливуд 64, Бэтман 8694, Спектр 1729, Кубок 1459, Кодек 1452 оказались носителями мутантного CV аллеля. Голливуд 64 получил мутацию от отца-носителя Горацио 78987165, который в свою очередь мутантный аллель получил от матери, поскольку отец Темтор 504924 был неносителем. Что касается Кубока 1459 и Кодека 1452, то они получили CV аллель от отца-носителя Конвинкера 2249055.

Племенные быки Бэтман 8694 и Спектр 1729 оказавшиеся носителями CV мутации, получили ее от своих матерей, поскольку их отцы Баклан 6352 и Сапфир 6985 оказались неносителями. Исходя из анализа полученных материалов, следует, что эти животные были правнуками и прапраправнуками Карлин М. Айвенго Белла 1667366.

Анализ 601 образца крови и семени от элитных быков и быковоспроизводящих групп коров черно-пестрого голштинизированного скота из различных регионов Российской Федерации на наличие CV аллеля показал, что носителями данной мутации в гетерозиготной форме являются 23 животных или 3,8%, а число особей с нормальным генотипом соответственно оказалось равным 578 или 96,2%. Причем, число носителей CV аллеля у быковоспроизводящих групп коров (n=17) было почти в 3 раза больше, чем у быков-производителей (n=6).

Примечание: красным цветом представлены зарубежные быки, носители CV аллеля, от которых получены российские быки, они обведены, синим цветом

Рис. 2. Генетическая генеалогия носителей CV аллеля в линии Монтвик Чифтейн 95679 из ОАО «ГЦВ СЖ» Как и с CV носителями, аналогичная ситуация складывается и по BL аллелю, только число быковоспроизводящих групп коров-носителей (n=25) было почти в 2 раза больше, чем быков-производителей с данной мутацией (n=14). Тем не менее, встречаемость BL аллеля у племенных быков и коров была выше, чем число животных с CV мутацией [табл. 2].

У всей исследованной группы животных (n=601), встречаемость CV аллеля составила 0,0191 или 1, 91%, а BL - 0,0324 или 3,24%. У быков эти данные составили соответственно 0,0063 (0,63%) и 0,0148 (1,48%). Относительно коров, эти данные выглядели следующим образом: CV - 0,0669 или 6,69%, а BL - 0,0984 или 9,84%.

Как видно из табл. 2, встречаемость CV и BL аллелей у племенных коров выше, чем у быков. Это связано с тем, что племенные коровы, находящиеся в стаде становятся своеобразным резерватом по сохранению мутантных CV и BL аллелей.

Относительно быков-носителей мутаций и созданного от них спермобанка, то они удаляются из племенных станций. Наличие в отечественных популяциях мутантных BL и CV аллелей связано как с завозом быков ( носителей, так и с получением отечественного племенного материала. Карлин М. Айвенго Белл 1617366 оказался основным распространителем источника CVM и BLAD в мире, России и других странах СНГ.

Проведенный анализ показал, что животные-носители BL и CV оказались в России в середине 80-х годов, т.е. до разработки метода ДНК-диагностики. В настоящее время главные формы распространения мутантных CV и BL аллелей это быковоспроизводящие группы коров, продажа или покупка животных-носителей, эмбрионов, через искусственное осеменение не аттестованным семенем.

Табл. 2. Частота встречаемости генотипов и аллелей


загрузка...