Механизмы дизрегуляции рецептор-опосредованной активации Т-лимфоцитов крови при туберкулезе легких (25.09.2012)

Автор: Кошкина Анна Алексеевна

Кроме того, в индуктивной фазе иммунного ответа путем апоптоза удаляются Т-лимфоциты, не получившие адекватного костимуляторного сигнала при взаимодействии антигенспецифического рецептора с презентируемым антигеном. Активация процесса апоптоза в данном случае зависит от NFAT1-индуцированной экспрессии апоптотического фактора FasL в ответ на неадекватный антигенный стимул, определяющий гибель Т-клетки [Сибиряк С.В. и соавт., 2006; Gwack Y. et al., 2007]. В пользу данного предположения может свидетельствовать зарегистрированное в настоящем исследовании снижение относительного числа CD28-позитивных Т-лимфоцитов у больных ТЛ, максимально выраженное при ЛУТЛ (рисунок 1).

Однако следует отметить, что гипопродукция IL-2, а также снижение числа CD3+CD28+IL-2+ лимфоцитов у больных ТЛ могут быть обусловлены анергией Т-клеток. Выявленное у больных ТЛ увеличение содержания CD28(IL2( и CTLA-4+ Т-клеток на фоне выраженной Т-лимфоцитопении и гипосекреции IL-2, вероятно, связано с увеличением количества и функциональной активности Т-регуляторных клеток, способных супрессировать процессы лимфопролиферации, вызывая развитие гипо- и анергии Т-лимфоцитов [Чурина Е.Г. и соавт., 2010; 2011].

Таким образом, у больных ТЛ отмечается существенное снижение числа Т-лимфоцитов, гипосекреция IL-2 при CD3/CD28-индукции и изменение процентного соотношения субпопуляций CD3-позитивных клеток, проявляющееся снижением IL-2-синтезирующих (IL-2+) Т-клеток, увеличением числа CD28- и IL-2-негативных лимфоцитов, а также CD3+CTLA-4+ клеток. Выявленные изменения носят в большей степени однонаправленный характер и максимально выражены у пациентов с лекарственно-резистентным вариантом туберкулезной инфекции. Учитывая, что передача активационного сигнала в процессе межклеточной кооперации, опосредованная Т-клеточным рецептором и костимуляцией через CD28, является одним из ключевых моментов формирования противотуберкулезного иммунитета, выявленные изменения в Т-лимфоцитах при ТЛ могут свидетельствовать о неспособности Т-клеток эффективно отвечать на антигенный стимул, что приводит к выраженной гипосекреции IL-2.

Как уже отмечалось ранее, активация CD3-TCR лимфоцита при участии корецептора CD4 и костимулирующей молекулы CD28 на Т-клетках приводит к запуску механизмов сигнальной трансдукции, конечным итогом которых (применительно к Th1-ответу) является секреция IL-2 и экспрессия его поверхностного рецептора [Bromley S.K. et al., 2001; Пименов А.А. и соавт., 2003; Ярилин А.А., 2003; Wang H. et al., 2005; Ивашкин В.Е., 2008]. Активация CD3-TCR/CD28 приводит к запуску цепочки тирозиновых киназ Fyn, Lck, ZAP70, вызывающих расщепление фосфатидилинозитолдифосфата с образованием диацилглицерола и инозитолтрифосфата. Последний высвобождает из внутриклеточных депо Са2+, необходимый для активации кальциневрина, который, в свою очередь, дефосфорилирует цитоплазматическую форму ядерного фактора транскрипции NFAT (Nuclear Factor of Activated T-cells), способствуя, тем самым, его транслокации в ядро. Диацилглицерол активирует протеинкиназу С и белок Ras. Последний способствует фосфорилированию протеинкиназы Raf, запускающей сигнальный каскад митоген-активированных белков (MAPK и MAPKK (Мек)). Активная протеинкиназа С при помощи Carma-1 (caspase-recruitment-domain-containing membrane-associated guanylate kinase 1) связывается с фосфорилированным белком Bcl-10. Протеин Bcl-10 взаимодействует с каспазоподобной протеазой MALT-1, которая в последующем активирует комплекс I?B-киназ (IKK). Следствием является фосфорилирование ингибитора ?B (I?B) по двум близкорасположенным остаткам серина (32 и 36), что служит сигналом для убиквитинации и последующей деградации молекулы I?B в 26S-протеосомах с освобождением из связи с ингибитором фактора транскрипции NF-?B. Параллельно этому в каскаде МАР-киназ активируются ядерная форма транскрипционного фактора (ТФ) NFAT (NFATn). Совместное действие ядерных факторов NFATc, NFATn, объединенных в полноценный транскрипционный фактор NFATc/n, и NF-kB включает в ядре «ранние гены» клеточной пролиферации Fos и Jun и промотор AP-1, который (взаимодействуя с NFAT) активирует транскрипцию генов IL-2 (IL2) и его рецептора (CD25) [Kintzel P.E., Calis K.A., 1991; Chang C.P. et al., 2004; Hayden M.S., Ghosh S., 2004; Monaco C. et al., 2004; Macian F., 2005; Абатуров А.Е., 2006; 2007; Gilmore T.D., 2006; Ивашкин В.Е., 2008; Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008; Hayden M.S., Ghosh S., 2008; Зенин В.В. и соавт., 2009].

Таким образом, ключевыми звеньями в механизмах трансдукции сигнала стимуляции секреции основного Th1-ассоциированного цитокина – IL-2, является активация ТФ NF-?B, AP-1 и NFAT. С этих позиций было проанализировано количество CD3-позитивных лимфоцитов, содержащих активные формы указанных ТФ в условиях CD3/CD28-индукции клеток in vitro.

Как показали результаты проведенного исследования, у больных ТЛ отмечается снижение относительного и абсолютного числа CD3+NF-?B+ лимфоцитов относительно показателей у здоровых доноров, наиболее выраженное при диссеминированной форме ЛУТЛ. При этом количество CD3+AP-1+ лимфоцитов у больных ЛЧТЛ оставалось в пределах нормы, повышалось у больных инфильтративным ЛУТЛ и снижалось при диссеминированной его форме (рисунок 3).

Низкая активность NF-?B и AP-1 при ТЛ, вероятно, связана с недостаточностью активационного сигнала, обусловленной снижением экспрессии молекулы костимуляции CD28, а также увеличением супрессорного влияния CTLA-4-молекулы, согласно выявленному у пациентов с ТЛ повышению численности экспрессирующих ее Т-клеток.

Среди вариантов инактивации сигнальных каскадов, опосредованных CTLA-4, рассматривают негативное его влияние на активность I?B-киназ, в результате которого нарушаются процессы фосфорилирования I?B и освобождения активного гетеродимера NF-?B [Olsson C. et al., 1999; Dias S.R., Rudd C.E., 2001; Абатуров А.Е., 2006; Меньшикова Е.Б. и соавт., 2006; Mukherjee S. et al., 2006; Маянский А.Н. и соавт., 2007; Абатуров А.Е., 2008; Goronzy J., Weyand C., 2008; Ahmed A., 2009]. Зарегистрированный в настоящем исследовании дефицит CD28-позитивных Т-лимфоцитов на фоне увеличения числа CTLA-4+ Т-клеток, вероятно, может являться причиной низкой активности NF-?B и снижения численности субпопуляции NF-?B+ Т-клеток.

Известно, что ТФ NF-?B и AP-1 являются редокс-чувствительными и отвечают за изменение окислительно-восстановительного баланса клетки, индикатором которого служит соотношение про- и антиоксидантов. Активация процессов свободнорадикального окисления служит своего рода индуктором ТФ NF-?B и AP-1. С другой стороны, антиоксиданты (каталаза, супероксиддисмутаза (СОД), глутатион), являются ингибиторами транскрипционной активности. В исследованиях показано, что активность NF-?B резко блокируется в присутствии ацетилцистеина, глутатиона, СОД [Долинная Н.Г. и соавт., 2008]. Вместе с тем, установлено, что у больных ТЛ отмечаются высокие значения активности СОД в лимфоцитах крови независимо от клинической формы заболевания при ЛЧТЛ, а также у пациентов с диссеминированным ЛУТЛ [Есимова И.Е., 2007; Шилько Т.А., 2009]. Вероятно, этим фактом можно объяснить выявленное нами низкое содержание NF-?B+ и AP-1+ Т-лимфоцитов у пациентов с диссеминированной формой ЛУТЛ.

Не исключено, что снижение числа NF-?B-позитивных Т-лимфоцитов может быть обусловлено угнетением синтеза субъединиц ТФ, связанным с нарушениями процессов биосинтеза белка при ТЛ [Ing R. et al., 2000; Poddar M.K. et al., 2000; Перельман М.И., 2007].

Высокий уровень CD3+AP-1+ лимфоцитов, выявленный у больных инфильтративным ЛУТЛ, на фоне снижения числа CD3+NF-?B+ клеток, по всей видимости, свидетельствует о реализации альтернативных путей активации «ранних генов» клеточной пролиферации Fos и Jun и промотора AP-1, не связанных с NF-?B (рисунок 3).

Кроме того, была показана ингибирующая роль глюкокортикостероидов (ГКС) на активность ТФ NF-?B, AP-1, NFAT [Абатуров А.Е., 2008]. ГКС, проникая в цитоплазму клетки, взаимодействуют с гормонсвязывающим доменом С-конца изоформы ? глюкокортикостероидного рецептора (GR), локализованного в цитоплазме и представляющего собой мультикомплекс. ГКС-активированный GR оказывает ингибирующее влияние на MAPK-, MAPKK- и I?B-киназы, активирует синтез белков I?B, взаимодействует с субъединицами p50 и p65 NF-?B (и, вероятно, c-Jun AP-1), подавляя их транскрипционную активность [Абатуров А.Е., 2008]. Высокие концентрации ГКС могут вносить определенный вклад в формирование дефицита NF-?B- и AP-1-позитивных Т-клеток при ТЛ.

Как уже отмечалось, еще одним важным ТФ, оказывающим влияние на промотор гена IL2 и синтез одноименного цитокина, является NFAT. Для зрелых Т-лимфоцитов характерно присутствие двух цитоплазматических форм NFAT – NFAT1, NFAT2. Блокада экспрессии NFAT в Т-лимфоцитах сопровождается снижением активности IL-2-промотора и угнетением синтеза цитокина [Pongracz J.E., Stockley R.A., 2006; Felix N.J. et al., 2010; Walsh N.P. et al., 2011; Poirier N. et al., 2011; Zelante T., 2012]. Считается, что промотор гена IL2 низко селективен в отношении ТФ NFAT, однако существует мнение, что NFAT2 является наиболее эффективным активатором транскрипции гена IL2. Блокада гена NFAT2 сопровождается снижением пролиферативного ответа Т-лимфоцитов, в то время как отмена экспрессии NFAT1, напротив, приводит к усилению спонтанной и антиген-стимулированной Т- и В-клеточной пролиферации с повышением доли активированных клеток в обеих популяциях [Arguni E. et al., 2006; Абатуров, А.Е., 2007; Oh-hora M., Rao A., 2009; Kang H., 2010].

Измерение количества Т-лимфоцитов, содержащих активную форму NFAT2, позволило установить снижение (ниже нормы) процентного и абсолютного числа CD3+NFAT2+ клеток у больных ЛЧТЛ и ЛУТЛ (рисунок 4). Исключение составили пациенты с инфильтративным ЛУТЛ, у которых численность данной субпопуляции Т-лимфоцитов не отличалась от нормальных величин и была значимо выше аналогичных показателей в других обследуемых группах (рисунок 4). В то же время, количественный анализ Т-клеток, содержащих активную форму NFAT1, позволил зарегистрировать существенное увеличение относительного и абсолютного числа CD3+NFAT1+ лимфоцитов у больных инфильтративным ЛУТЛ и низкие показатели численности CD3+NFAT1+ клеток при диссеминированном ЛЧТЛ. При остальных формах ТЛ количество CD3+NFAT1+ лимфоцитов оставалось в пределах нормы (рисунок 4).

Установленные нарушения могут быть связаны с недостатком активной формы NFAT2 в цитозоле клеток в результате снижения ее синтеза, сопряженного с дефицитом биосинтеза белка, характерного для ТЛ [Ing R. et al., 2000; Poddar M.K. et al., 2000; Перельман, М.И., 2007]. Снижение числа NFAT2-позитивных Т-лимфоцитов может быть обусловлено активацией СОД в клетках, оказывающей негативное влияние на активность NFAT2. Косвенно, в пользу данного предположения свидетельствует установленный в более ранних работах высокий уровень активности СОД при инфильтративном и диссеминированном ЛЧТЛ и диссеминированной форме ЛУТЛ [Есимова И.Е., 2007; Шилько Т.А., 2009]. Именно при этих формах ТЛ определялось снижение числа CD3+NFAT2+ клеток в настоящем исследовании. При этом инфильтративный ЛУТЛ, по данным Т.А. Шилько [2009], характеризуется нормальными показателями активности СОД. В настоящем исследовании численность NFAT2-позитивных Т-лимфоцитов при данной форме ТЛ оставалась в пределах нормы.

Кроме того, нельзя исключить и влияние высоких доз ГКС, регистрируемых при ТЛ, на снижение количества NFAT2+ Т-клеток [Абатуров А.Е., 2008].

Уменьшение содержания NFAT1-позитивных Т-лимфоцитов у пациентов с диссеминированным ЛЧТЛ, вероятно, связано с теми же причинами, что и снижение числа CD3+NFAT2+ клеток.

Выявленное в работе повышенное содержание NFAT1-позитивных Т-лимфоцитов при инфильтративном ЛУТЛ может свидетельствовать об усилении активности данного ТФ. Так, было показано, что при инфильтративной форме ЛУТЛ лимфоциты характеризуются наиболее высоким содержанием фосфатидилинозитола в мембране клеток и высоким уровнем внутриклеточного Ca2+. Кроме того, как уже было отмечено, при данной форме ТЛ регистрируются нормальные показатели активности ферментов антиоксидантной защиты [Есимова И.Е., 2007; Шилько Т.А., 2009]. Известно, что фосфатидилинозитол является предшественником вторичных мессенджеров – диацилглицерола и инозитолтрифосфата. Инозитолтрифосфат регулирует Са2+-зависимую активацию кальциневрина, который, в свою очередь, является прямым активатором NFAT [Chang C. et al., 2004; Hayden M., Ghosh S., 2004; Monaco C. et al., 2004; Macian F., 2005; Gilmore T.D., 2006; Ивашкин В.Е., 2008; Hayden M., Ghosh S., 2008; Зенин В.В. и соавт., 2009]. В данной ситуации вероятным механизмом активации NFAT1 и, соответственно, регистрируемого увеличения числа CD3+NFAT1+ клеток, может являться повышенная активность кальциневрина. При этом можно предположить, что преимущественная в данной ситуации активация NFAT1, а не NFAT2, связана с низким содержанием последнего в цитозоле клеток.

Особое внимание обращало на себя соотношение NFAT1/NFAT2-позитивных Т-лимфоцитов при туберкулезной инфекции. Так, например, известно, что NFAT1-белок участвует в негативном контроле пролиферации Т-лимфоцитов за счет инициации экспрессии FasL [Gomez-Sintes R. et al., 2010; Alvarez S. et al., 2011]. Увеличение числа Т-лимфоцитов, содержащих активную форму NFAT1, у больных инфильтративным ЛУТЛ в сочетании с нормальным количеством NFAT2+ клеток, вероятно, оказывает негативное влияние на количество CD3+ лимфоцитов, что, возможно, вносит вклад в снижение численности CD3-субпопуляции клеток при данной форме ТЛ и снижение их IL-2-секреторной функции.

Кроме того, показана способность NFAT2 и NFAT1 (в комплексе друг с другом) существенно усиливать транскрипцию гена IL4 на начальных этапах активации, взаимодействуя с пурин-богатыми последовательностями промотора, с последующим NFAT2-ингибированием на поздней фазе транскрипции гена IL4 [Zador E., 2008; Zhang Y. et al. 2009; Lee S.H. et al., 2009; Lohoff M. et al., 2010; Saito R. et al., 2011]. Снижение количества CD3+NFAT2+ лимфоцитов у больных ТЛ при нормальном или увеличенном содержании CD3+NFAT1+ клеток позволяет предположить дезинтеграцию в работе изучаемых ТФ, приводящую, по всей видимости, к нарушению ингибирования поздней фазы транскрипции гена IL4, увеличению IL4-продуцирующей активности Т-клеток и переключению их активации с Th1- на Th2-иммунный ответ. Это также может вносить определенный вклад в гипопродукцию IL-2.

Таким образом, полученные нами данные позволяют заключить, что при ТЛ нарушение взаимодействия APC и Т-лимфоцитов, приводящее к низкой IL-2-секреторной активности, гипо- и анергии Т-клеток, является комплексным, многоуровневым и обусловливается как влиянием супрессорных механизмов (в том числе посредством CTLA-4), так и дефицитом CD28-костимуляции и нарушением процессов сигнальной трансдукции в лимфоцитах крови вследствие снижения числа Т-клеток, содержащих активные формы внутриклеточных транскрипционных факторов (NF-?B, NFAT2, AP-1) (рисунок 5). Это, несомненно, расширяет имеющиеся фундаментальные представления о патогенезе туберкулезной инфекции и, возможно, послужит основой модуляции иммунного ответа, профилактики и лечения иммунозависимых болезней.

При инфильтративном и диссеминированном лекарственно-чувствительном и лекарственно-устойчивом туберкулезе легких гипосекреция in vitro IL-2 (фактора роста и активации Т-клеток), характеризующая состояние гипоэргии Т-клеточного звена иммунитета, определяется дефицитом общего числа CD3+, CD28+, IL-2+ лимфоцитов и их CD3+CD28+IL2+ CD3+CD28+IL2( субпопуляций на фоне повышения количества CD3+CD28(IL2( Т-лимфоцитов в крови.

Снижение секреции IL-2 и количества IL-2+ и CD28+ Т-лимфоцитов в условиях рецептор-опосредованной индукции in vitro у больных туберкулезом легких ассоциировано с повышением абсолютного и относительного числа клеток, экспрессирующих цитотоксический Т-лимфоцитарный антиген 4 (CTLA-4) с иммуносупрессорной активностью.

Изменения рецептор-экспрессирующей и IL-2-продуцирующей активности Т-клеток у больных туберкулезом легких (ТЛ) варьируют в зависимости от клинической формы заболевания с большей выраженностью дефицита CD3+, CD28+, IL-2+ лимфоцитов в крови и базальной секреции IL-2 при диссеминированном лекарственно-устойчивом ТЛ (ЛУТЛ), а гипосекреции IL-2 при CD3/CD28-индукции in vitro – при инфильтративном ЛУТЛ.

Дизрегуляция трансдукции сигнала рецептор-опосредованной активации Т-лимфоцитов при индукции антиCD3- и антиСD28-антителами in vitro у больных инфильтративным и диссеминированным туберкулезом легких определяется дефицитом в клетках активных форм транскрипционных факторов NF-?B и NFAT2, наиболее выраженным при диссеминированном туберкулезе легких с устойчивостью возбудителя к препаратам этиотропной терапии.

Рисунок 5. Механизмы нарушений активации Т-лимфоцитов крови при туберкулезе легких по данным литературы и результатам собственных исследований (выделено серым)

Инфильтративный лекарственно-устойчивый туберкулез легких (ЛУТЛ) сопровождается увеличением числа Т-лимфоцитов, содержащих активные формы транскрипционных факторов NFAT1 и AP-1, в то время как диссеминированный туберкулез легких сопровождается снижением количества клеток с иммунофенотипами CD3+NFAT1+ (при лекарственно-чувствительном его варианте) и CD3+AP-1+ (при ЛУТЛ).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Писаренко, М.С. Роль полиморфизма гена IL-12В в цитокинзависимой активации Т-хелперов 1 типа у больных инфильтративным туберкулезом легких [Текст] / М.С. Писаренко, А.А. Кошкина // Актуальные проблемы патофизиологии: материалы XVII Межгородской конференции молодых ученых. – СПб., 2011. – С. 126-127.

Клинико-иммунологическая характеристика Beijing-туберкулеза в Томской области [Текст]: материалы IX Съезда фтизиатров России / О.В. Воронкова, Р.Р. Хасанова, О.И. Уразова, З.К. Хаитова, И.Е. Есимова, А.А. Кошкина // Туберкулез и болезни легких, 2011. – №4. – С. 96.

Цитокинпродуцирующая активность мононуклеарных лейкоцитов крови при туберкулезе легких с множественной лекарственной устойчивостью [Текст]: материалы IX Съезда фтизиатров России / Р.Р. Хасанова, О.В. Воронкова, О.И. Уразова, З.К. Хаитова, И.Е. Есимова, А.А. Кошкина // Туберкулез и болезни легких. – 2011. – №5. – С. 209-210.

Продукция интерлейкина-2 лимфоцитами периферической крови у больных туберкулезом легких в условиях CD3/CD28 индукции in vitro [Текст] / А.А. Кошкина, М.С. Писаренко, И.Е. Есимова // Актуальные проблемы патофизиологии: материалы XVIII Межгородской конференции молодых ученых. – СПб., 2012. – С. 74-76.

Писаренко, М.С. Т-клеточные механизмы нарушений индуктивной фазы иммунного ответа при туберкулезе легких [Текст] / М.С. Писаренко, А.А. Кошкина // Материалы Всероссийской 71-й итоговой студенческой научной конференции им. Н.И. Пирогова / СибГМУ; под ред. В.В. Новицкого, Н.В. Рязанцевой. – Томск, 2012. – С. 57-58.

Причины дизрегуляции иммунного ответа при туберкулезе легких: влияние M. tuberculosis на течение иммунитета [Текст] / И.Е. Есимова, В.В. Новицкий, О.И. Уразова, Р.Р. Хасанова, А.А. Кошкина, Чурина Е.Г. // Бюллетень сибирской медицины. – 2012. – №3. – С. 79-86.

Кошкина, А.А. Субпопуляционный состав CD3+-лимфоцитов крови и особенности CD3/CD28-индуцированной секреции интерлейкина 2 у больных туберкулезом легких [Текст] / А.А. Кошкина, М.С. Писаренко, И.Е. Есимова // Актуальные вопросы охраны здоровья населения регионов Сибири: материалы X Научно-практической конференции молодых ученых. – Красноярск, 2012. – С. 26-30.

Особенности CD3/CD28-индуцированной секреции интерлейкина 2 и субпопуляционный состав Т-лимфоцитов крови у больных туберкулезом легких [Текст] / А.А. Кошкина, В.В. Новицкий, О.И. Уразова, И.Е. Есимова, Р.Р. Хасанова // Бюллетень Восточно-сибирского научного центра СО РАМН. – 2012. – №3, ч.2. – С. 92-95.

Кошкина, А.А. Механизмы дизрегуляции рецепторопосредованной сигнальной трансдукции в Т-лимфоцитах крови при туберкулезе легких [Текст] / А.А. Кошкина // Фундаментальные исследования. – 2012. – №8, ч.1. – С. 91-95.

Причины дизрегуляции иммунного ответа при туберкулезе легких: роль нарушений исходного состояния иммунологической реактивности организма [Текст] / И.Е. Есимова, В.В. Новицкий, О.И. Уразова, Р.Р. Хасанова, А.А. Кошкина, Е.Г. Чурина // Бюллетень сибирской медицины. – 2012. – №4. – С. 93-98.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ДТЛ – диссеминированный туберкулез легких


загрузка...