Новые бактериальные патогены в пищевых продуктах6 экспериментальное обоснование и разработка системы контроля с применением методов микробиологического и молекулярно-генетического анализа. (25.01.2010)

Автор: Ефимочкина Наталья Рамазановна

Публикация результатов исследований. Основные положения диссертации опубликованы в 2 монографиях и 66 научных работах, в том числе 20 – в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 327 страницах машинописного текста, состоит из введения, 11 глав, заключения, выводов, списка литературы, включающего 445 наименований, в том числе 355 на иностранных языках. Работа содержит 102 таблицы и 61 рисунок.

Личный вклад автора составляет более 80% и заключается в формулировании проблемы, постановке цели и задач работы, выборе методов исследования, выполнении аналитической и экспериментальной работы, обобщении и интерпретации полученных данных, подготовке научных публикаций. Теоретические и экспериментальные исследования выполнялись лично автором и совместно с другими исследователями в НИИ питания РАМН в рамках программ и планов НИР №№ 030, 087, 111, 018, 063, 095.

Автор выражает искреннюю глубокую благодарность доктору медицинских наук, академику РАМН, профессору В.А.Тутельяну, заслуженному деятелю науки и техники Российской Федерации, доктору биологических наук, профессору И.Б. Куваевой, доктору медицинских наук С.А. Шевелевой, доктору биологических наук, профессору И.С. Тартаковскому за поддержку, консультативную помощь и сотрудничество.

CОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Организация проведения работ, материалы и методы исследований

Аналитическая часть работы включала литературный поиск, сбор информационных и статистических материалов, публикуемых в отечественных и зарубежных научных изданиях, в официальных сборниках Роспотребнадзора и ФГУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии», Международной программы ВОЗ по контролю и надзору за пищевыми инфекциями и токсикоинфекциями в Европе, Центра по контролю заболеваемости в США и других опубликованных источниках.

Всего обработано свыше 480 публикаций отечественных и зарубежных авторов. Собранный материал обобщен, систематизирован и опубликован издательством РАМН в виде монографии «Эмерджентные бактериальные патогены в пищевой микробиологии» (Н.Р.Ефимочкина, 2008) и справочно-обзорного издания «Листерии в молоке и молочных продуктах» (в соавторстве с И.Б.Куваевой и С.Н.Карликановой, 1999 г.).

Материалы о вспышках пищевых бактериальных отравлений и острых кишечных инфекций в Российской Федерации в период с 1992 по 2006 г.г. обработаны с использованием формализованных схем и включены в Международные сборники программы ВОЗ по контролю и надзору за пищевыми инфекциями и токсикоинфекциями в Европе.

Экспериментальная часть исследований проведена в 1989 – 2009 г.г. в лаборатории санитарно-пищевой микробиологии и микроэкологии НИИ питания РАМН (с 1989 г. по 1998 г. руководитель лаборатории - Заслуженный деятель науки и техники РФ, доктор биологических наук, профессор Куваева И.Б., далее – доктор медицинских наук Шевелева С.А.).

Отдельные этапы экспериментальных работ, включая методическое обоснование и технику выполнения молекулярно-генетических исследований L.monocytogenes проведены на базе лаборатории легионеллеза НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН под руководством доктора биологических наук, профессора Тартаковского И.С. Исследования микробиологического состава и свойств молока, сыра и других молочных продуктов, касающиеся непосредственно обнаружения L.monocytogenes, S.aureus и др., выполнены в творческом сотрудничестве с лабораториями ГНУ ВНИИМС и ГНУ ВНИМИ Россельхозакадемии.

Для разработки новых и усовершенствованных методов анализа использовали приборы и диагностические средства (тест-системы, реактивы, питательные среды и др.), представленные в рамках договоров о научном сотрудничестве с ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, фирмами «Ниармедик плюс», «Стайлаб», «Дюпон», «Био-Мерье».

Работа проводилась с использованием музейных и промышленных штаммов, полученных из коллекций ГИСК им. Л.А.Тарасевича, НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН, Всеросийской коллекции микроорганизмовИнститута биохимии и физиологии микроорганизмов РАН. В экспериментах также использовали штаммы энтеробактерий, выделенных из пищевых продуктов, смывов и клинического материала в ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в г. Москве». Всего использовано свыше 300 штаммов бактерий и микроскопических грибов, подробные характеристики которых приведены в соответствующих главах и разделах данной работы.

В работе были использованы коллекционные и выделенные штаммы бактерий рода Listeria (L.monocytogenes, L.innocua, L.ivanovii, L.welshimeri – всего около 200 штаммов), E.coli – 75 штаммов, Salmonella spp. – 11 штаммов, Enterobacter sakazakii – 7 штаммов, других видов семейства Enterobacteriaceae – 190, S. аureus – 137 штаммов, B.cereus – 11 штаммов, Lactobacillus spp. – 66 штаммов, Campylobacter spp. – 5 штаммов, Penicillium citrinum – 17 штаммов (всего более 600 штаммов).

Объектами исследования служили образцы сырья и пищевых продуктов различных групп, а также смывы с поверхностей оборудования, инвентаря, посуды, вспомогательных средств на разных стадиях производства и этапах хранения готовой продукции (свыше 1700 образцов). Отбор проб проводили в соответствии с утвержденными стандартными методами на конкретные виды пищевой продукции.

Выделение и изучение свойств эмерджентных патогенов проводили с использованием стандартных методов микробиологических исследований. Для подтверждения и сравнительного сопоставления полученных данных подбирали или разрабатывали специализированные и адаптированные к поставленным задачам методики, подробное изложение которых приведено в соответствующих разделах диссертационной работы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Анализ распространенности некоторых патогенных микроорганизмов в пищевых продуктах и объектах окружающей среды

Оценивая рейтинг возбудителей по частоте возникновения вспышек, числу пострадавших и тяжести заболевания, международные организации (например, ФАО/ВОЗ) относят к числу наиболее важных эмерджентных патогенов следующие виды: бактерии рода Salmonella, в том числе S.enteritidis и S.typhimurium DT104; энтерогеморрагические E.coli; Listeria monocytogenes;Campylobacter jejuni;Yersinia enterocolitica.

Характеризуя роль этих микроорганизмов в возникновении эмерджентных пищевых инфекций, следует отметить, что их доминирующее влияние было установлено в результате анализа этиологии и патогенеза массовых вспышек заболеваний в различных странах мира начиная с 70-80-х гг. двадцатого века. Подавляющее большинство вспышек относились к пищевым зоонозам и возникали как вследствие потребления продуктов, полученных от больных животных, так и в результате вторичной контаминации при заготовке и переработке животноводческого сырья, в процессе приготовления и хранения пищи. В данной работе изучены особенности распространения, частота и источники выделения наиболее значимых эмерджентных пищевых патогенов L.monocytogenes, Campylobacter spp., EHEC, Salmonella spp.

L.monocytogenes.

Существующие данные об обнаружении листерий в мясопродуктах весьма противоречивы и свидетельствуют о разных уровнях выявления L. monocytogenes (от 0,5% до 30-40% проб в количествах от 0,1 до 103 КОЕ/г и более) и широкой распространенности наиболее близких к ним по фенотипическому профилю листерий, в первую очередь вида L.innocua. При этом используются различные методические схемы идентификации штаммов листерий, что затрудняет сопоставление полученных данных и существенно усложняет анализ ситуации [Beumer R.R. et al., 1996; Farber J.M. et al., 1999; Wilson I.G., 1995].

Несмотря на большое число зарубежных публикаций о выделении L. monocytogenes на различных пищевых предприятиях, данных о частоте обнаружения листерий на отечественных заводах крайне недостаточно. Для получения информации о циркуляции этого возбудителя на предприятиях пищевой индустрии проведено изучение распространения бактерий рода Listeria при производстве мясных продуктов (табл. 1).

Таблица 1

Частота обнаружения бактерий рода Listeria на мясоперерабатывающих предприятиях

Объект исследования Число исследованных проб Частота обнаружения бактерий рода Listeria (%) В том числе:

L.monocyto-genes L.innocua L.welshimeri

Говядина – сырье 14 5 (35,7%) 1 4 0

Свинина – сырье 7 4 (57,1%) 2 2 0

Полуфабрикаты мясные рубленые 19 7 (36,8%) 3 4 0

Полуфабрикаты мясные кусковые 12 3(25,0%) 2 1 0

Сырокопченые и сыровяленые колбасы 19 6 (31,6%) 1 5 0

Смывы с поверхности оборудования, инвентаря, посуды 72 24

(32,4%) 15 6 3

Всего 143 49 (34,3 %) 24 (16,8%) 22 3

Установлено, что в технологических циклах происходит постоянное инфицирование объектов производственной среды бактериями рода Listeria, частота обнаружения листерий на поверхностях оборудования достигала 71,4%, инвентаря – 29,2%, что безусловно может приводить не только к обсеменению сырья, но и к загрязнению готовых мясных изделий. Из 24 культур, предварительно идентифицированных как L.monocytogenes 9 штаммов (37,5 %) обладали типичными для этого возбудителя факторами патогенности. Наибольшее число штаммов (77,6%) относились к виду L. innocua. Три штамма, выделенные из смывов, были идентифицированы как L. welshimeri. Другие виды листерий в данном исследовании обнаружены не были.

Частота обнаружения L.monocytogenes в смывах с технологического оборудования и инвентаря - 9,7 % - свидетельствует об интенсивной циркуляции возбудителя листериоза на мясоперерабатывающих предприятиях и требует ужесточения санитарно - гигиенических требований к производству и хранению мясопродуктов. С этой целью должен быть регламентирован и налажен контроль на наличие L.monocytogenes не только в сырье и готовой продукции, но и наиболее значимых участков технологических процессов, включая посев смывов с технологического и холодильного оборудования, инвентаря, посуды, вспомогательных материалов, рук и одежды работников.

Фекальным загрязнением объясняется преимущественно контаминация листериями сырого молока. По данным многочисленных анализов сырого сборного молока в течение ряда лет было показано, что частота обнаружения L. monocytogenes в основном колеблется в пределах от 1 до 12% от числа исследованных проб. Попадание такого сырья на завод обуславливает постепенное накопление возбудителя и массивную контаминацию помещений предприятия, оборудования, инвентаря, создавая условия вторичного обсеменения готовых молочных продуктов.

Источниками экзогенного, или постсекреторного обсеменения сырого молока являются корма, включая сено и концентраты; частота обнаружения в них L.monocytogenes варьирует от 1 до 8,7 % [Farber J.M., 1989; Husu J.R., 1990], и вероятность такого способа заражения сырого молока очень велика даже при отсутствии на фермах больных животных. Это в свою очередь может приводить не только к попаданию возбудителя в заготавливаемое сырье, но и к заражению емкостей, в которых собирают молоко на фермах, посуды, инвентаря и т.п.

Исследования по выявлению листерий в образцах сырого молока, полученных в хозяйствах Центрального региона РФ (свыше 60 проб) показали, что 5,7% проб содержали L.monocytogenes в количестве до 100 КОЕ/см3 (табл. 2). Листерии обнаруживали на фоне высокого уровня микробной контаминации молока, санитарно-гигиенические характеристики которого свидетельствовали о неудовлетворительных условиях производства и хранения молочного сырья: уровень колиформных бактерий колебался в зависимости от сезона, в летне-осенний период количество БГКП в молоке достигало величин 107 – 108 КОЕ/см3 и в среднем находилось на уровне 5 х 106 КОЕ/см3; содержание бактерий рода Enterococcus превышало 104 КОЕ/см3.


загрузка...