Клиника и эффективность лечения туберкулёза и бактериальных заболеваний лёгких в условиях хронической табачной интоксикации (экспериментальные и клинические исследования) (24.10.2011)

Автор: Шпрыков Александр Сергеевич

Исследования проводили в лаборатории туберкулёза, инфекционных и инвазивных заболеваний животных научно-исследовательский ветеринарный институт Нечерноземной Зоны Российской Федерации Российской академии сельскохозяйственных наук (г. Н.Новгорода) - (зав. лабораторией, д.м.н., проф. А.Л. Лазовская), в бактериологической лаборатории Канавинского противотуберкулёзного диспансера г. Н.Новгорода (зав. лабораторией Л.С. Финкельштейн, Е.И.Полуэктов) и в бактериологической лаборатории ГУЗ НО «Клиническая инфекционная больница №2 г.Н.Новгорода» (зав. лабораторией, к.м.н. – О.Н. Шпрыкова). В связи с важным биологическим значением белковых систем бактерий были исследованы электрофоретическим методом спектры белков мембраны K.pneumoniae (10 штаммов) и экзобелков S.aureus (5 штаммов). Исследование проводили в отделении микробиологии и биохимии бактерий Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н. Блохиной (зав. лабораторией д.б.н., проф. Г.К. Дёгтева) по методике Devis и Ornstein, Weber и Osborn.

Результаты экспериментальных микробиологических исследований

В виду большого значения микробного фактора в патогенезе и клинике инфекционных заболеваний лёгких и для проведения экспериментально-клинических сопоставлений нами были изучены биологические свойства и лекарственная чувствительность, основных возбудителей бактериальных инфекций дыхательной системы: M.tuberculosis, S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginоsa, S. аureus в условиях воздействия конденсата табачного дыма.

Для изучения жизнеспособности проведено комплексное экспериментальное исследование со штаммами 4688 и Н37Ra M.tuberculosis. Всего было выполнено 5 серий посевов субкультур в 3-х повторностях для каждого штамма на средах с 5-ю разведениями конденсата табачного дыма: 1-е – 10 мг /мл, 2-е - 1 мг/мл, 3-е - 0,1 мг/мл, 4-е - 0,01 мг/мл, 5-е - 0,001 мг/мл.

Результаты опытов показывают, что на средах с 3-им (0,1 мг/мл) и 5-ым (0,001 мг/мл) разведениями конденсата для штамма 4688, с 3-им (0,1 мг/мл) и 4-ым (0,01 мг/мл) разведениями для штамма Н37Ra отмечали чёткое увеличение роста субкультур, однако только культура МБТ, выросшая на среде с 3-м разведением КТД, соответствует критерию «высокая жизнеспособность», так как рост более 100 колоний был получен за 21 день, что в 1,5 раза быстрее, чем в контроле. Другие разведения конденсата табачного дыма либо оказывали ингибирующее действие на рост субкультур M.tuberculosis, либо были индифферентны.

Таким образом, результаты экспериментов полностью подтверждают полученные нами ранее клинические данные об увеличении жизнеспособности M.tuberculosis под влиянием продуктов табачного дыма.

Изучены биологические свойства бактериальных возбудителей внебольничных и госпитальных пневмоний: S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginоsa, S. аureus. Всего было выполнено по 5-6 серий экспериментов с каждым из возбудителей на средах с 5-ю разведениями конденсата табачного дыма и контролем.

Массивность роста субкультур S. pneumoniae была максимальной на средах с 4-м (0,01 мг/мл) разведением конденсата и соответствовала 4,1 единиц мутности по Мак Фарланду. Увеличение по сравнению с контролем составило 28,1% (р<0,05).

При изучении свойств H. influenzae установлено, что 5-ое (0,001 мг/мл) разведение конденсата дало рост сходный с контролем, 1-ое (10 мг/мл), 2-ое (1 мг/мл) и в меньшей степени 3-е (0,1 мг/мл) разведения оказали угнетающее воздействие. Наибольший интерес представляло 4-ое (0,01 мг/мл) разведение, на котором отмечали самый обильный рост культуры, составивший 1293 колониеобразующих единиц (КОЕ) (в среднем по 5 опытам). Увеличение по сравнению с контролем составило 25% (р<0,05) (Рис.5). Рост был в виде более влажных и сливающихся колоний; микроскопически чаще, чем в контроле, отмечался выраженный полиморфизм. Изменение биохимических свойств носило разнонаправленный характер, наряду с подавлением некоторых ферментативных реакций (на 1-ом -10 мг/мл и 2-ом - 1 мг/мл разведениях конденсата) отмечалось усиление (или ускорение) ряда биохимических реакций на 3 – ем (0,1 мг/мл), 4-ом (0,01 мг/мл) и 5-ом (0,001 мг/мл) разведениях конденсата (окисление глюкозы, утилизация лактозы, мочевины, индолообразование) по сравнению с контролем.

Рис.5. Рост культуры H.influenzae на средах с разведениями конденсата табачного дыма (средние значения 5 серий опытов), в КОЕ/мл.

Опыты, проведённые с K. рneumoniaе, показали угнетающее действие максимальных концентраций конденсата табачного дыма на рост субкультур бактерий, что не отличало её от других микроорганизмов и проявилось в появлении меньшего количества колоний, более мелких и сухих, чем в контроле. Самый обильный рост дали 5-е (0,001 мг/мл) и, особенно, 4-е (0,01 мг/мл) разведения конденсата. На 5-м (0,001 мг/мл) разведении рост культур примерно соответствовал контролю, а в 4-м (0,01 мг/мл) разведении был обильнее, чем в контроле (на 12%). В этих же разведениях отмечалась более выраженная визуально (++) биохимическая реакция Фогес-Проскауэра по сравнению с контролем (+), остальные биохимические свойства соответствовали контролю.

В экспериментах выявлено также выраженное угнетающее действие максимальных концентраций продуктов табачного дыма на рост S. аureus. Колонии вырастали в меньшем количестве, были мелкие и сухие. Умеренное ингибирующее действие проявило 3-е (0,1 мг/мл) разведение, давшее уменьшение количества колоний примерно на 10%. Рост колоний после воздействия 4-ого (0,01 мг/мл) и 5-ого (0,001 мг/мл) разведений конденсата соответствовал контролю. Микроскопическое обследование и биохимические тесты различий не выявили.

При исследовании P. aeruginоsa выявлено супрессивное воздействие 1-го (10 мг/мл) и 2-го (1 мг/мл) разведений конденсата, рост колоний с 3-его (0,1 мг/мл) разведения примерно соответствовал контролю, с 4-го (0,01 мг/мл) и 5-го (0,001 мг/мл) разведений опережал контроль (на 12%). В этих разведениях отмечен факт появления 2-х видов колоний: выпуклых, слизистых, средних размеров и более мелких, плоских. Это явление можно рассматривать как пример диссоциации культуры при воздействии внешних факторов. По биохимическим свойствам культуры были идентичны, кроме теста на желатиназу. Субкультура, выросшая после 4 –ого (0,01 мг/мл) разведения, с более крупными слизистыми колониями, в отличие от контроля, разжижала желатин. Для микроскопии в данном случае характерно наличие в мазках изменённых по морфологии палочек в отличие от контроля.

Проведённые нами эксперименты позволяют утверждать, что продукты табачного дыма не безразличны для возбудителей неспецифических бактериальных респираторных инфекций. Рост на средах с 4-ым (0,01мг/мл) и реже с 5-ым (0,001 мг/мл) разведением конденсата табачного дыма достоверно изменял фенотип микроорганизмов (за исключением S. аureus): увеличивался размер колоний, появлялось повышенное слизеобразование, возникала диссоциация культур. Изменялись биохимические реакции. Отмечается ускорение роста S. pneumoniaе и H. influenzaе, в меньшей степени K. рneumoniaе и P. aeruginоsa , соответственно на 28,8% и 24,7% (р<0,05); 11,8% и 12,0% (р >0,05) после роста на средах с 4-ым (0,01мг/мл), в меньшей степени 5-ым, разведениями конденсата. Большой интерес вызывает получение максимального изменения фенотипа с выраженным увеличением массивности роста (до 30%) у S. pneumoniae и H. influenzae, т.е. у тех возбудителей, которые по общепризнанному мнению и литературным данным чаще вызывают пневмонии у табакокурильщиков.

Учитывая большое значение белковых систем в жизни микроорганизмов, проведено изучение спектра экзобелков для S. аureus и мембранных белков для K. рneumoniaе. Исследованию подверглись 5 культур S. аureus (4 опытных культуры, давших хороший рост на средах с 4-ым и 5-ым разведениями конденсата и одна контрольная) и 10 культур K. рneumoniaе (7 опытных культур, давших обильный рост на 4-ом (0,01мг/мл) разведении конденсата, и 3 контрольные культуры), всего 15 культур.

Как следует из полученных результатов, у абсолютного большинства (63,6%) опытных культур: у 2-х из 4-х S. аureus и у 5-ти из 7 K. рneumoniaе, после воздействия продуктов табачного дыма отмечено появление изменений на протеинограмме по сравнению с контрольными штаммами и ранее изученными культурами. Изменение белков имело место по всему спектру протеинограммы: как в низкомолекулярной части, так и в области более крупных белковых молекул.

Изученные белковые системы являются основой жизнедеятельности микробной клетки, что подтверждает и объясняет появление описанных выше структурно-функциональных изменений фенотипа бактериальных клеток.

Таким образом, комплексные экспериментальные микробиологические исследования выявили у некоторых разведений конденсата табачного дыма сложное многостороннее воздействие на основных возбудителей инфекционных заболеваний лёгких, состоящее в увеличении жизнеспособности M. tuberculosis (что соответствует клиническим данным), в изменении фенотипа и ускорении роста S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P.aeruginosa. Увеличение жизнеспособности, обильность роста возбудителей – одно из объяснений большей тяжести и торпидности течения бактериальной патологии лёгких у курящих больных. Причина этого, вероятно, кроется в сложном составе табачного дыма, состоящего из примерно 4700 химических соединений, часть из которых проникает внутрь микроорганизмов, что находит подтверждение в обнаруженном факте изменения спектра внеклеточных и мембранных белков. Многие из этих веществ не безразличны для микробных клеток, а некоторые близки к различным факторам роста бактерий.

В рутинных условиях табакокурения ситуацию усугубляет большое количество двуокиси углерода, составляющее до 13% основного потока табачного дыма. В микробиологии описан стимулирующий эффект СО2 на рост M. tuberculosis, S. pneumoniaе и H.influenzaе, что используется, согласно действующим приказам, для культивирования двух последних возбудителей.

Нами выполнено несколько серий экспериментов по изучению лекарственной чувствительности M. tuberculosis (штаммы 4688 и Н37Ra) после воздействия различных концентраций конденсата табачного дыма. В работу были включены 25 субкультур: 14 - штамма 4688 (12 опытных и 2 контрольных) и 11 - штамма Н37Ra (9 опытных и 2 контрольных). Выявлено формирование лекарственной устойчивости у большинства субкультур опытных штаммов (12 субкультур – 57,1%). Обращает на себя внимание, что культура, полученная от больных туберкулёзом (штамм 4688), оказалась в большей степени подвержена воздействию конденсата, чем лабораторный штамм Н37Ra: лекарственная устойчивость к различным противотуберкулёзным препаратам выявлена в 2/3 (штамм 4688) и 1/2 случаев (штамм Н37Ra). У штамма 4688 чётко отмечалась полирезистентность. В экспериментах преобладала устойчивость к изониазиду, несколько меньше к стрептомицину и рифампицину (соответственно 68, 58 и 42%).

Множественная лекарственная устойчивость M.tuberculosis у экспериментальных штаммов встречалась в 14,3%, среди субкультур 4688 почти в 1,5 раза чаще, чем среди Н37Ra (соответственно в 16,7% случаев против 11,1%). Это даёт возможность предположить, что культуры, полученные от больных, более легко формируют множественную лекарственную устойчивость, чем лабораторные штаммы. Вызывает интерес тот факт, что почти все случаи формирования множественной лекарственной устойчивости произошли при росте на средах с 3-м (0,1мг/мл) разведением конденсата, то есть у культур с высокой степенью жизнеспособности. Наши данные совпадают с сообщениями ряда авторов, которые подтверждают связь высокой жизнеспособности M. tuberculosis и множественной лекарственной устойчивости (Н.М.Корецкая и соавт.,2007; S. Gagneux, 2009).

В экспериментах диско-диффузионным методом изучено влияние продуктов табачного дыма на лекарственную чувствительность актуальных возбудителей неспецифических бактериальных инфекций лёгких.

При анализе антибиотикочувствительности S. pneumoniae выявлено уменьшение диаметра зоны задержки роста субкультур, выращенных на средах с конденсатом табачного дыма около дисков с эритромицином (на 25%), оксациллином (на 15%), левофлоксацином (на 14%). Наиболее выраженные изменения зафиксированы на средах с 3-им (0,1мг/мл) и 4-ым (0,01мг/мл) разведениями конденсата.

Исследования антибиотикочувствительности H.influenzaе выявили тенденцию к значительному уменьшению диаметров зон задержки роста к ряду антибиотиков: к цефотаксиму (на 30%), (р<0,05), левомицетину (на 15%), пефлоксацину (на 10%) и амоксиклаву (на 8%). Уменьшение зон задержки роста, свидетельствующее о возможном снижении лекарственной чувствительности, наблюдалась у субкультур, выросших на 3-ем (0,1мг/мл) и 4-ом (0,01мг/мл) разведениях конденсата (Табл. 6).

Таблица 6

Лекарственная чувствительность субкультур экспериментальных штаммов H.influenzaе, выросших на средах с различными разведениями конденсата табачного дыма (средние значения зон задержки роста в мм)

Разведения КТД (мг/мл) 1

0,001 К

Ампициллин 22 21 21 23 21 21

Амоксиклав 24 25 23 25 24 25

Гентамицин 21 20 20 20 19 20

Цефотаксим 23 23 19 21 26 27

Тетрациклин 19 18 18 20 20 18

Пефлоксацин 20 19 18 18 18 20

Левомицетин 25 23 25 23 24 27

После роста на средах с разведениями конденсата табачного дыма - в основном это 3-е (0,1мг/мл) и 4-е (0,01мг/мл) разведения - у культуры K. pneumoniaе выявлены выраженные изменения: уменьшение диаметров зон задержки роста к цефепиму (на 33%), (р<0,05), амоксиклаву (на 20%) и меропенему (на 19%). Менее значительное уменьшение зон задержки роста выявлено у цефотаксима (на 13%), пефлоксацина (на 7%). В опытах с K. pneumoniae, в отличие от других возбудителей, наиболее частые изменения наблюдались у субкультур, выращенных на средах с 4 – м (0,01мг/мл) разведением конденсата, преобладала как и у клинических штаммов устойчивость к ?-лактамным антибиотикам.

При постановке опытов со S. аureus существенных отличий в диаметрах зон задержки роста на средах с конденсатом и без конденсата выявлено не было, кроме небольшого уменьшения (на 10%) зоны задержки роста к гентамицину у культур в 3-ем (0,1 мг/мл) разведении.

При изучении изменений лекарственной чувствительности P.aeruginosa отмечено некоторое уменьшение диаметра зоны задержки роста субкультур вблизи диска с меропенемом (на 6 %) и изменение морфологии колоний.

Итак, в экспериментах выявлена тенденция к снижению лекарственной чувствительности у экспериментальных субкультур M.tuberculosis после роста на средах с конденсатом табачного дыма. Отмеченное неоднократное уменьшение диаметра зон задержки роста возбудителей неспецифических заболеваний, хотя и не выходит за пределы чувствительности в ряде случаев, свидетельствует о возможности развития лекарственной устойчивости к исследуемым антибактериальным препаратам.

Таким образом, результаты наших исследований показывают, что продукты табачного дыма в виде некоторых концентраций конденсата в эксперименте и в виде табакокурения в клинике влияют на лекарственную чувствительность к ряду антибактериальных препаратов у M. tuberculosis, S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniaе.


загрузка...