Биотехнологические аспекты вирусной безопасности препаратов иммуноглобулинов: методология, производство, стандартизация (24.09.2012)

Автор: Зубкова Наталия Васильевна

I 5,71±0,05

5,07±0,05 4,33±0,18

5,12±0,02

4,35±0,05

3,83±0,03 5,81

Общее 5,74±0,12 5,10±0,13 4,4±0,14 5,14±0,17 4,44±0,19 3,81±0,05 5,86 5,79-5,92

Графики зависимости концентраций МСО и ОСО от логарифма дозы (титра) представлены на рис.6. В данном случае при построении графиков использованы результаты измерений по всем циклам. Подобные графики строились также при обработке данных каждого цикла измерений.

Рис.6.Графики зависимости концентрации РНК ВГС от титра в МСО и ОСО.

CРНК ВГС (log10 МЕ/мл) – измеренное значение концентрации РНК ВГС, (log10 МЕ/мл)

Разработанный препарат зарегистрирован в Реестре отраслевых стандартов (ОСО 42-28-366(1)-11П). Аттестованная характеристика содержания РНК ВГС в ОСО составила 7,2х105 МЕ/мл или 3,6х105 МЕ/флакон, что эквивалентно 5,86 lоg10 МЕ/мл или 5,56 lоg10 МЕ/флакон соответственно. Наличие линейности и параллельности графиков для МСО и ОСО свидетельствовало, что исследуемые объекты имели одинаковую природу, содержали одно и то же активное вещество.

Расчеты методом параллельных линий выполнены с использованием модуля в программе Microsoft Excel. Методологический подход может быть рекомендован для аттестации стандартных образцов второго уровня, включая контрольные или стандартные образцы предприятия, которые необходимы для ежедневного мониторинга качества исследований. В Европейской фармакопее, например, рекомендовано при исследовании производственных пулов тестироватьб контрольный образец с концентрацией РНК ВГС 100 МЕ/мл [Human Plasma for fractionation. (2008:2073) In.European Pharmacopoeia].

В целом стандартизация генамплификационных методов исследований направлена на снижение риска вирусной контаминации плазмы для фракционирования. Однако гарантировать безопасность готовых препаратов можно только в том случае, если при их изготовлении используются методы, позволяющие эффективно удалять и инактивировать вирусы.

Разработка вирусбезопасной технологии производства препаратов иммуноглобулинов

???????ђ

?????????

???????????+

????1/4

?????????5

??????????

кционирования и при обработке гидроксидом алюминия. Однако эти технологические приемы не гарантируют полную безопасность продукта. Поэтому технологический процесс был усовершенствован и дополнен сольвент-детергентной стадией инактивации вирусов.

Оптимизацию условий вирусинактивирующей обработки осуществляли на основании изучения изменений физико-химических и биологических свойств IgG и вирулицидной активности используемых реагентов в диапазоне концентраций от 0,015% до 0,6% ТБФ и от 0,01% до 0,4% натрия холата. В результате нами был разработан следующий вариант СД-обработки: раствор IgG с концентрацией белка 4,5–6,5%, рН 6,5–7,5, стабилизированный глицином до концентрации 1%, обрабатывали стерильной СД- смесью в конечной концентрации 0,3% и 0,2% соответственно. Смесь выдерживали в течение 6 ч при температуре от 30°С до 37°С. При сравнении физико-химических и биологических показателей качества СД-обработанного препарата с иммуноглобулином, не подвергнутым вирусинактивирующей обработке, достоверных различий не обнаружено.

Для очистки иммуноглобулина от реагентов использовали оригинальный способ очистки (патент RU 2352358), включающий экстракцию сольвента и детергента растительным маслом с температурой затвердевания не ниже 8°С, например, маслом какао, специально обработанным с целью удаления вредных примесей. Стерильное масло какао добавляли в обработанный растворителем и детергентом иммуноглобулин до концентрации 5–10%. Смесь выдерживали при температуре 37–45°С, постоянно перемешивая. Затем раствор охлаждали до 8°С и инкубировали в течение 10–15 ч для затвердевания масла. В конце инкубации температуру раствора понижали до 1,5–2,5°С, что создавало благоприятные условия для удаления масла. Окончательную очистку от вирусинактивирующих реагентов осуществляли с помощью ультрафильтрации с одновременным снижением рН до 4,4–4,8. При апробации технологии в условиях производства часть серий препарата получали без стадии масляной экстракции, используя только ультрафильтрацию с увеличенной кратностью отмывки. Преимуществом варианта технологии без использования масла какао было упрощение технологического процесса. Контроль качества очистки от реагентов оценивали методом газовой хроматографии.

Остаточное количество реагентов устанавливали на основании полученных аналитических данных, требований Европейской фармакопеи, сведений о токсичности реагентов и опыта зарубежных производителей: для ТБФ – не более 2 мкг/мл, для холата натрия – не более 100 мкг/мл.

Изучена стабильность физико-химических и биологических свойств СД-обработанного иммуноглобулина при хранении. Состав и свойства иммуноглобулина оставались стабильными в течение 2,5 года. Отсутствовала фрагментация препарата, не отмечено статистически значимого изменения содержания мономерной и димерной форм. Комплексная проверка серий препаратов по тестам, принятым Российским Фармакопейным Комитетом, позволила установить, что они полностью соответствовали требованиям, предъявляемым к иммуноглобулинам для внутривенного введения.

Разработанный вариант СД-обработки может быть использован в технологии производства препаратов иммуноглобулинов как для внутривенного, так и для внутримышечного введения. Технология легко встраивается на разных стадиях технологического процесса, не требует дорогостоящего оборудования.

Однако механизм действия СД-реагентов ограничивает область применения этой технологии и не решает проблему безопасности препаратов в отношении вирусов без липидной оболочки. Поэтому были предприняты попытки поиска новых химических соединений с другим механизмом вирулицидного действия. Критерии выбора были следующими: вещества не должны денатурировать белки и вызывать канцерогенного или тератогенного эффектов, должны быть изучены с точки зрения фармакологических свойств и применяться в фармацевтической промышленности (табл. 7).

Таблица 7

Характеристика химических веществ, используемых для инактивации вирусов

Наименование соединения Группа Использование в технологии лекарств

Каприлат натрия Производное жирной кислоты, детергент При производстве альбумина

Бензалкониум хлорид Смесь алкилбензилдиметиламмония хлорида (С6 до С18), ПАВ Консервант в готовых лекарственных формах

Карбоплатин Комплексное соединение платины, алкилирующее вещество Лекарственный препарат. Цитостатик

Хлорамбуцил Производное бис-?-хлорэтиламина, алкилирующее вещество Лекарственный препарат. Цитостатик

Механизм действия каприлата натрия и бензалкониума хлорида заключается в связывании мембранных белков и разрушении липидной оболочки вирусов. Мишенью же нуклеофильных соединений, к которым относятся карбоплатин и хлорамбуцил, является геном вируса, и это делает эти вещества особенно перспективными для разработки новых технологий с расширенным спектром действия.

В модельных опытах in vitro и in vivo, а также на основании изучения физико-химических свойств IgG были определены дозы, обеспечивающие вирулицидный эффект, и оптимальные условия обработки. Результаты представлены в табл. 8.

Показано, что при использовании разных концентраций хлорамбуцила в водном растворе уровень редукции ВГС был невысоким. По-видимому, это связано с низкой растворимостью хлорамбуцила в воде. Предварительное растворение хлорамбуцила в димексиде или в ТБФ обеспечивало повышение уровня редукции.

Таблица 8

Вирусинактивирующие дозы и условия обработки IgG каприлатом натрия, бензалкониумом хлоридом, карбоплатином и хлорамбуцилом

Вещество/

изученный диапазон концентраций Оптималь-ная кон-центрация в растворе IgG Оптимальные условия обработки Уровень редукции


загрузка...