Патогенетические механизмы алкогольной и опийной зависимости как основа ее объективной диагностики и контроля лечения (23.08.2010)

Автор: Павленко Валерий Петрович

1. У больных алкогольной и опийной зависимостью выявляются достаточно устойчивые и повторяющиеся патобиохимические признаки заболевания в форме изменения активности состояния нейромедиаторных (дофамин-, ГАМК- и глутаматергической), этанолокисляющих (активность алкоголь- и альдегиддегидрогеназ) и энергостабилизирующих (активность креатинкиназы) систем. Общим для больных алкоголизмом и опийной наркоманией является снижение содержания ГАМК в крови, зависимое от сроков воздержания от наркогена. В то же время у больных алкоголизмом регистрируются умеренные колебания активности МАО-В и уровней аутоантител к NMDA-рецепторам и их субъединице NR2A в сыворотке крови, тогда как у больных опийной наркоманией уровень аутоантител к NMDA- и мю-опиоидным MDOR-рецепторам стабильно повышен.

2. Степень патобиохимических изменений у больных алкоголизмом зависит от состояния пациента и времени воздержания от употребления алкоголя. При остром воздействии алкоголя и алкогольном абстинентном синдроме вышеуказанные изменения более выражены, чем в процессе формирования и стабилизации ремиссии.

3. Наиболее значимыми патобиохимическими маркерами для объективной диагностики алкогольной зависимости являются повышенная активность алкогольдегидрогеназы (АДГ) и изменение изоферментного спектра креатинкиназы крови в сторону повышения мозговой (ВВ-) и сердечной (МВ-) изоформ фермента. Между давностью алкоголизма и повышением активности АДГ в крови выявляется прямо пропорциональная зависимость. Между степенью тяжести алкогольного абстинентного синдрома и активностью креатинкиназы крови также выявляется прямо пропорциональная зависимость.

4. Актуализация влечения к алкоголю в период клинической ремиссии у больных алкоголизмом сопровождается более высокими значениями активности печеночных ферментов (АДГ, гамма-глутамилтранспептидаза) и холестерина липопротеидов высокой плотности, чем у больных без актуализации. Эти показатели сохраняются в период до 2 лет ремиссии.

5. У больных опийной наркоманией наиболее значимыми патобиохимическими маркерами для объективной диагностики зависимости является повышенные уровени аутоантител к NMDA-подтипу глутаматных и мю-опиоидным MDOR-рецепторам.

6. В процессе становления клинической ремиссии и ее стабилизации аутоиммунные изменения в системе функционирования мю-опиоидных MDOR-рецепторов сохраняются, что создает предпосылки для лабораторного использования этих показателей как биохимических маркеров состояния пациента и контроля его лечения.

Реализация результатов работы. Материалы исследования используются в лекционном курсе кафедр патофизиологии и фармакологии Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова МО РФ, кафедры наркологии Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования МЗ РФ, кафедры психиатрии Актюбинской медицинской академии (Казахстан), внедрены в практику работы Ленинградского, Новгородского и Актюбинского областных наркологических диспансеров.

Апробация и публикация материалов исследования. Материалы, вошедшие в диссертацию, доложены на научной конференции «Нейрохимия. Фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005), региональном конгрессе Европейского общества нейропсихофармакологии ECNP (Москва, 2005), VII Всероссийской научной конференции «Нейроэндокринология-2005» (Санкт-Петербург, 2005), 15-й научно-практической конференции «Нейроиммунология» (Санкт-Петербург, 2005), XIV съезде психиатров России (Москва, 2005), IV Всероссийской конференции «Механизмы функционирования висцеральных систем», посвященной 80-летию Института физиологии им. И.П.Павлова РАН (Санкт-Петербург, 2005), 4-й международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2006), 5-м международном конгрессе патофизиологов (Пекин, 2006), 23-м конгрессе Европейского общества нейропсихофармакологии ECNP (Стамбул, 2009).

По теме диссертации опубликованы 42 работы, включая 28 статей, из них 13 статей в журналах, рекомендованных ВАК, 13 тезисов в сборниках научно-практических работ, 1 монография.

Апробация диссертации прошла на совместном заседании кафедр фармакологии, патофизиологии и НИЛ военной психофармакотерапии Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, главы обзора литературы, материалов и методов исследования, трех глав результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Работа изложена на 253 страницах машинописного текста, содержит 27 таблиц и 15 рисунков. Библиографический указатель включает 475 ссылок (179 отечественных и 296 на иностранных языках).

Методы исследования

Общая структура исследования. В исследование было включено 590 больных с наркологической патологией: 443 больных алкоголизмом и 147 злоупотребляющих опиатами, госпитализированных в клиники Актюбинского и Ленинградского областных наркологических диспансеров в 2000-2008 гг. В исследование были включены пациенты мужского пола в возрасте от 18 до 44 лет. Контрольную группу составили 122 здоровых испытуемых, мужчин в возрасте 30-35 лет, не употребляющих транквилизаторов, наркотических и седативных средств, не злоупотребляющих алкоголем и опиатами и не имеющих в анамнезе черепно-мозговых травм (ЧМТ). Исследование одобрено комитетом по этике Актюбинской медицинской академии (Республика Казахстан).

Исследования проводили в острый период (состояние абстиненции) и в период ремиссии. В группы больных алкоголизмом и наркоманией были включены пациенты с алкогольным (ААС) и опийным (ОАС) абстинентным синдромом средней степени тяжести. Состояние ремиссии констатировали на основании отсутствия в крови и моче алкоголя или опиатов, катамнестических данных и бесед с родственниками. Также в группу исследуемых включали пациентов, направленных на обследование в связи с призывом в ряды Вооруженных сил РФ (направление военкомата), на период обследования не получавшие лечения.

Методы клинического обследования больных алкоголизмом и опийной наркоманией. Для постановки клинического диагноза у больных анализировали анамнестические сведения (анамнез жизни, перенесенные и сопутствующие заболевания, наркологический анамнез) и результаты объективного осмотра (неврологический и соматический статусы, осмотр терапевта и невропатолога). Всем больным проводили стандартное клинико-лабораторное обследование: клинический и биохимический (активность аланин- и аспартатаминотрасфераз, содержание мочевины, С–реактивного белка) анализы крови, общий анализ мочи и кала. Данные перенесенного гепатита подтверждались выявлением носительства австралийского антигена (HBsAg). Для исключения острой патологии сердечно-сосудистой системы регистрировали ЭКГ. Больным алкоголизмом проводили психологическое обследование по тесту мотиваций потребления алкоголя (МПА). Для стандартизации оценки анамнестических данных, состояния больного и результатов обследования применяли «Карту осмотра наркологического больного». Здесь же указывали на день исследования показатели гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), активность моноаминоксидазы типа В (МАО-В), уровень титра аутоантител к глутаматным (GLU) и опиатным (MDOR) рецепторам, активность алкогольдегидрогеназы (АДГ), креатинкиназы (КК), гамма-глутамилтранспептидазы (ГГТ), липидного спектра крови. Исследование соматического состояния, биохимических показателей и уровня титра аутоантител проводили на 1-й, 5-й, 10-й, 20-й и 30-й дни после поступления и у пациентов в состоянии ремиссии. Указанные параметры регистрировали непосредственно перед забором анализа крови из локтевой вены утром, натощак.

Из исследования исключали пациентов с психотическими заболеваниями, не связанными с наркологической патологией, и пациентов с острым соматическим состоянием (острый инфаркт миокарда, инсульт, острое состояние после черепно-мозговой травмы, грипп, острая респираторно-вирусная инфекция и т.п.).

Характеристика групп больных алкоголизмом. В процессе обследования на основании наркологического анамнеза и психологического тестового обследования (тест мотивации потребления алкоголя), устанавливали диагноз и стадию заболевания. В группы исследования методом случайной выборки отбирали больных II стадией алкоголизма (со сформировавшейся алкогольной зависимостью по МКБ-10), которые были разделены на несколько подгрупп: 1) общая (сводная) группа больных алкоголизмом; 2) больные алкоголизмом в ремиссии: а) имеющие в анамнезе психозы; б) имеющие в анамнезе судорожные припадки; 3) больные алкоголизмом в остром состоянии (ААС); 4) больные алкоголизмом в остром состоянии с психотическими проявлениями.

Группы больных статистически достоверно не различались между собой по возрасту, длительности заболевания и алкогольных эксцессов (запоев), длительности светлых промежутков, давностью формирования абстинентного синдрома и толерантности. С первого дня поступления все больные в состоянии ААС получали стандартную детоксикационную терапию.

Характеристика групп больных опийной наркоманией. В процессе обследования больные методом случайной выборки были разделены на несколько групп в зависимости от степени выраженности заболевания, способа употребления наркотического препарата и вида потребляемого наркотика: 1) злоупотребление опиатами без явлений физической зависимости; 2) наркозависимые с сочетанным употреблением разных опиатов (героин, ацетилированная маковая соломка внутривенно); 3) наркозависимые с чередованием употребления разных опиатов (героин или ацетилированная маковая соломка внутривенно). Указанное разделение на группы предполагало дополнительную биохимическую характеристику пациентов по уровню аутоантител к глутаматным и опиатным рецепторам. С первого дня поступления все больные в состоянии ААС получали стандартную детоксикационную терапию.

Сроки забора материала на исследование. Для исследования биохимических показателей крови у пациентов натощак забирали около 5 мл крови из вены, центрифугировали при комнатной температуре и получали сыворотку, которую хранили при температуре -20оС – -70оС до времени анализа.

Биохимические методы исследования обмена нейромедиаторов, уровня аутоантител к рецепторам, активности этанолокисляющих и энергостабилизирующих систем в крови

Методика определения содержания ГАМК в крови. Определение концентрации ГАМК проводили на спектрофлюориметре «Люминал» при использовании волн 380 и 450 нм на основании оценки концентрации образования флуоресцентного продукта между ГАМК и нингидрином при щелочном рН в присутствии глутаминовой кислоты (Sutton J., Simmonds H., 1974).

Методика определения активности моноаминоксидазы тромбоцитов. Для определения моноаминоксидазной активности тромбоцитов (МАО-В) сначала выделяли взвесь тромбоцитов (Балуда В.П. и др., 1980). Определение активности МАО-В тромбоцитов проводили по методу О. Н. Волошиной и Т. А. Москвитиной (1985).

Методика исследования влияния этанола на активность моноаминоксидазы тромбоцитов больных алкоголизмом in vitro. Тромбоциты выделяли традиционным методом (Балуда В.П. и др., 1980). Раствор 400 мМ этанола готовили на основе фосфатного буфера с рН=7,4. Активность фермента определяли спектрофотометрическим методом с использованием в качестве специфического субстрата 0,045 М раствора солянокислого бензиламина (Москвитина Т.А., Волошина О.Н. 1985) и выражали в нмолях на 1 мг белка в час. Содержание белка в тромбоцитах определяли по методу О.Н.Лоури (1951).

Определение уровня аутоантител к NMDA-рецепторам методом твердофазного иммуноферментного анализа. Уровень аутоантител к глутаматным рецепторам определяли с помощью набора «ЭПИТЕСТ» (Россия) согласно инструкции. Набор реагентов теста предназначен для полуколичественного иммуноферментного определения содержания аутоантител к синтетическому фрагменту глутаматсвязывающего белка (ГМБ) головного мозга человека в сыворотке крови. Сорбция синтетического фрагмента ГМБ на поверхности полистиролового планшета позволяет избирательно извлекать аутоантитела из сыворотки крови. Образовавшийся комплекс антиген-антитело выявляется с помощью вторых антител против иммуноглобулинов человека, конъюгированных с пероксидазой. Уровень аутоантител к ГМБ оценивается по изменению окраски субстратной смеси, регистрируемой с помощью спектрофотометра вертикального сканирования при длине волны 492 нм.

Определение уровня аутоантител к опиоидным рецепторам методом твердофазного иммуноферментного анализа. Принцип работы набора «НАРКОТЕСТ» (Россия) состоит в выявлении аутоантител к синтетическому фрагменту мю-опиатных рецепторов (MDOR) головного мозга человека. Сорбция синтетического фрагмента MDOR на поверхности полистиролового планшета позволяет избирательно извлекать аутоантитела из сыворотки крови или ликвора сходно с тем, как описано выше для «ЭПИТЕСТА». Уровень аутоантител к MDOR оценивается по изменению окраски субстратной смеси, регистрируемой с помощью спектрофотометра вертикального сканирования при длине волны 490 нм.

Определение активности ферментов обмена этанола (алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы) в сыворотке крови больных алкоголизмом. С целью выяснения диагностического значения ферментов обмена этанола алкогольдегидрогеназы (АДГ) и альдегиддегидрогеназы (АлДГ), креатинкиназы и обмена липидов был исследован 326 больных алкоголизмом II стадии (со сформированной алкогольной зависимостью по МКБ-10), мужчин в возрасте 18–66 лет, госпитализированных в наркологические стационары Санкт-Петербурга и Актюбинска (Республика Казахстан), и 94 здоровых добровольцев, проходивших плановые обследования в терапевтическом стационаре. Пациентов распределяли по группам в соответствии с различными сроками воздержания от алкоголя. Часть больных со сроками ремиссии более одного месяца на основании клинического обследования была подразделена на две подгруппы: с актуализацией и без актуализации влечения к алкоголю.

Цель наших исследований состояла в том, чтобы с помощью высокочувствительного метода определения активности АДГ изучить влияние хронического злоупотребления алкоголем и острой алкогольной интоксикации на активность АДГ в сыворотке крови людей и оценить возможность применения алкогольдегидрогеназного теста (Усатенко М. С., Шабанов П. Д., 1998) для диагностики алкоголизма. Активность АДГ в сыворотке крови значительно ниже, чем в печени. До недавнего времени считалось, что активность АДГ в сыворотке крови здоровых людей не определяется. Однако нами был модифицирован высокочувствительный метод определения активности АДГ, с помощью которого была измерена активность фермента в сыворотке крови всех обследованных ими здоровых людей и изучена динамика его активности в крови больных алкоголизмом.

Принцип метода основан на способности АДГ катализировать две последовательные реакции: 1) окисление бутанола с участием НАД; 2) восстановление n-нитрозодиметиланилина (НДМА) посредством НАДН2, образовавшимся в ходе первой реакции. НДМА, имеющий в растворе интенсивную желтую окраску, при восстановлении обесцвечивается. Об активности АДГ судят по скорости обесцвечивания НДМА, которую регистрируют на спектрофотометре при длине волны 440 нм. Определение активности АДГ каждой сыворотки проводили дважды, а в случае расхождения результатов измерения более чем на 10% – три раза и вычисляли среднюю величину изменения оптической плотности за 1 минуту.

Расчет активности АДГ производили по формуле: А = 320,5 х ?Е440, где

А – активность фермента, выраженная в единицах и рассчитанная на 1 л сыворотки крови. За единицу (Е) фермента принято то его количество, которое катализирует превращение 1 микромоля НАД в минуту при указанных условиях инкубации;

?Е440 – изменение оптической плотности инкубационной среды при 440 нм за 1 минуту;

320,5 – коэффициент расчета активности, выраженной в микромолях прореагировавшего субстрата (НАД) при указанных условиях инкубации.

Было найдено, что активность АДГ достоверно определяется у всех обследованных лиц контрольной группы (89 здоровых добровольца) и равняется в среднем 1,19 ± 0,07 Е/л. Эти результаты соответствуют другим исследованиям, в которых было найдено, что активность АДГ сыворотки крови обследованных ими людей колеблется в пределах 0,05–4 Е/л при 25?С (Шабанов П.Д., 2002, 2003).

Отдельную серию исследований составило изучение влияния высоких доз этанола (острой алкогольной интоксикации) на АДГ крови. Динамику активности АДГ изучали на мужчинах, поступивших в медицинский вытрезвитель в состоянии алкогольного опьянения, и на не злоупотреблявших алкоголем добровольцах, которые в течение 30 мин приняли 500–600 мл 40% раствора этанола (2,0–2,5 г/кг). Активность АДГ сыворотки крови у лиц, поступивших в вытрезвитель, измеряли сразу после поступления и через 12 ч, у добровольцев — перед приемом алкоголя и через 1; 1,5; 6; 12 и 22 ч после его приема. На основании результатов клинического анализа всех обследованных, находившихся в состоянии опьянения средней и тяжелой степени, разделяли на 3 группы. В 1-ю группу вошли больные алкоголизмом (n=38), во 2-ю – лица, злоупотреблявшие алкоголем, у которых не было обнаружено признаков алкогольной болезни (n=21), а в 3-ю – 12 человек, употреблявших алкогольные напитки эпизодически, в том числе добровольцы.

Определение активности изоферментов креатинкиназы в сыворотке крови больных алкоголизмом. Изоферменты креатинкиназы (КК) ММ-, МВ- и ВВ-типа являются тонким и объективным показателем поражения нервной ткани и миокарда (Чуваев И.В., 1993). ММ-КК содержится преимущественно в скелетных мышцах, МВ-КК — в сердце и ВВ-КК — в нервной ткани.

Определение общей активности КК производили колориметрическим методом (Чуваев И. В., 1993). Чувствительность метода составила 0,005–0,05 МЕ фермента в пробе. Разделение изоферментов КК осуществляли с помощью колоночной хроматографии на сефадексе ДЭАЕ А-50. Элюцию изоферментов КК проводили ступенчатым методом, используя три буфера, которые содержали 100 мМ NaCl, 200 мМ NaCl и 400 мМ NaCl. В каждой фракции проводили определение активности КК. Определение белка проводили микробиуретовым методом.

В первой серии исследований определяли изоферментные спектры КК в сыворотке крови 40 больных алкоголизмом с наличием алкогольного абстинентного синдрома. Последний дифференцировали по степени тяжести как умеренный (I), средней тяжести (II) и выраженный (III). Разделение изоферментов КК осуществляли методом колоночной хроматографии на сефадексе ДЭАЕ А-50. Контролем служили сыворотки крови 15 здоровых добровольцев.

Методы статистического анализа. Результаты клинических исследований обрабатывались методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента. Анализ результатов проводили на PC Intel Pentium II 600 мГц. Для статистической обработки результатов использовался стандартный пакет программ STATISTICA for Windows (Тюрин Ю.Н., Макаров А.А., 1998).

Результаты собственных исследований


загрузка...