Структура и экспрессия MMTV-родственного провируса у больных раком молочной железы (23.08.2010)

Автор: Лушникова Анна Александровна

Лушникова Анна Александровна

Структура и экспрессия MMTV-родственного провируса

у больных раком молочной железы

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

14.01.12. - Онкология

Москва 2010

Работа выполнена в НИИ канцерогенеза, Учреждения Российской Академии медицинских наук Российского Онкологического Научного Центра им.Н.Н.Блохина РАМН; директор – академик РАН и РАМН, профессор М.И.Давыдов.

Научный консультант:

Доктор биологических наук И.Н.Крюкова

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор З.Г.Кадагидзе

Доктор биологических наук, профессор Г.Г.Миллер

Доктор биологических наук, профессор В.С.Прасолов

Ведущая организация:

Учреждение Российской Академии медицинских наук Институт вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМН

Защита состоится « 28 » октября 2010 г. в часов на заседании Диссертационного совета Д.001.017.02 РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН по адресу: 115478 Москва , Каширское шоссе, 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН

Автореферат разослан « » 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Ю.В.Шишкин

Общая характеристика работы

1.1. Актуальность проблемы

Рак молочной железы (РМЖ) составляет около 15% всех злокачественных неоплазий человека и занимает первое место по заболеваемости и по смертности от онкологических заболеваний[ среди российских женщин. (Чистяков и др., 2009, Любченко Л.Н., 2009). Существуют значительные межпопуляционные различия частот заболеваемости РМЖ, причем у мигрантов, приезжающих в страны с высокой частотой РМЖ заболеваемость со временем также растет. Это указывает на специфичные факторы риска РМЖ. В последнее десятилетие появилось множество работ, посвященных вирусной этиологии РМЖ. В частности, были проанализированы частоты распределения в ткани РМЖ штаммов HPV высокого риска и их ассоциация с онкопатологией молочной железы (Khan N.A. et al. 2008, Mendizabad-Ruiz A.P. et al. 2008). В качестве возможного этиологического агента РМЖ в некоторых популяциях рассматривается также вирус Эпштейна-Барр (EBV). Однако, вероятность участия этих вирусов в развитии РМЖ у человека мала и доказательств в пользу данной гипотезы пока недостаточно (Mant C., Cason J. , 2009; Lawson J.S., Gunzburg W.H., Whitaker N.J., 2006). В литературе широко обсуждается роль в канцерогенезе молочных желез семейства эндогенных бета-ретровирусов человека (HERV), которое содержит около 830 элементов и составляет 8-9% от генома человека. С помощью микрочипов было показано, что уровень транскрипции 18 членов семейства, включая HERV-T, HERV-F, HML-6 и др., в нормальной и опухолевой ткани протокового РМЖ различен (O.Frank et al. 2008). В других исследованиях была выявлена корреляция между высоким уровнем экспрессии в опухолевой ткани провирусов группы HERV-K и РМЖ (Flockerzi A. еt al. 2008) . Однако, значимых различий по уровню транскрипции наиболее специфичных для РМЖ провирусов HERV-K113 и HERV-K115 между здоровыми женщинами и пациентками с РМЖ соответствующего возраста не обнаружено (Burmeister et al. 2004).

В последнее время появились новые данные, проливающие свет на роль в канцерогенезе МЖ человека ретровируса, родственного вирусу опухолей молочных желез мышей (MMTV). Этот ретровирус, впервые описанный Дж. Биттнером в 1936 г., относится к онкогенным ретровирусам типа В (Betaretroviruses) и индуцирует РМЖ у мышей (Coffin J.M et al. 1999). Жизненный цикл MMTV связан с лимфоцитарным путем циркуляции в организме и вертикальной (эндогенный mmtv) или горизонтальной (экзогенный MMTV) передачей потомству. В геноме человека выявлено несколько классов MMTV-гомологичных последовательностей эндогенного (НML-2, HML-6, HERV-K) и экзогенного происхождения (hMTV, HMTV, HBRV). Экзогенные MMTV–родственные ретровирусы были обнаружены как в ткани РМЖ, так и в перипортальных лимфатических узлах, а также в эпителии печеночных протоков у пациентов с первичным билиарным циррозом (L.Hu et al. 2009). Последовательности с высокой гомологией гену env MMTV выявлены с помощью гнездовой ПЦР в опухолевых клетках, экспрессирующих рецепторы к прогестерону (PrR), в 16% (14/89) образцов рака яичников, 36% (53/147) - рака простаты, 10% (5/50) - рака эндометрия, 9% (13/141) - рака кожи ( Johal H. et al. 2010). В сыворотках крови и в опухолевой ткани российских больных РМЖ и некоторых здоровых женщин были обнаружены антигены, иммунологически родственные белкам MMTV (Kryukova I.N., Komarova E.A., 1980; А.А.Лушникова и др. 1998). Была выявлена экспрессия этих белков in vitro в 13% опухолевых клеток из нескольких первичных культур РМЖ человека. (Melana S.M. et al. 2009; Taneja P. et al. 2009).

Вопрос об участии MMTV-родственного ретровируса в кацерогенезе ряда опухолей МЖ человека активно обсуждается, начиная с 1970-1980 гг., и по-прежнему актуален (Zotter S. еt al. 1981; Westley B. Et al., 1984; Salmons B. et al., 1987; Лушникова А.А. 2007). Какова роль hMTV в патогенезе и его вклад в прогрессию РМЖ и других неоплазий человека? Существуют ли принципиальные структурно-функциональные отличия мышиного и человеческого ретровирусов и в чем они заключаются? Каковы особеннсти биологии hMTV: его циркуляции в организме человека, путях передачи и возможных механизмах канцерогенеза? Несмотря на то, что известны некоторые структурные элементы генома и соответствующие нуклеотидные последовательности провируса hMTV, остается неясным, ассоциированы ли они с онкопатологиями молочной железы и другими неоплазиями человека. Решение этих вопросов важно для фундаментальной вирусологии и молекулярной биологии ретровирусов; ответ на них позволит обосновать риск заболеваемости РМЖ и сочетанными неоплазиями, расширить возможности предклинической диагностики РМЖ .

1.2. Цель и задачи исследования

Целью данной работы является изучение особенностей структуры и экспрессии MMTV-родственного провируса (hMTV) в лимфоидной и опухолевой ткани больных с различными типами РМЖ. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

Выявить и проанализировать особенности геномной структуры hMTV в разных группах больных РМЖ.

Сравнить их структуру с каноническими геномными последовательностями МMTV.

Охарактеризовать специфичные функционально значимые области генома МMTV-родственного провируса (hMTV).

Изучить экспрессию этих областей генома hMTV в лимфоидной и опухолевой ткани больных, страдающих РМЖ с помощью ОТ ПЦР, нозерн- и/или вестерн-гибридизации.

Предложить доступный метод обнаружения экспрессирующегося провируса в периферической крови и/или опухолевой ткани МЖ, пригодный для клинической практики.

1.3. Научная новизна

Впервые в России нами проанализирована структура и экспрессия hMTV в группах больных с различными клиническими характеристиками: со спорадическим и наследственным РМЖ, ассоциированным с беременностью и лактацией РМЖ (РМЖАБ), с листовидными опухолями молочной железы, с двусторонним РМЖ, РМЖ в сочетании с неоплазиями ЖКТ и гемобластозами, с РМЖ и гинекомастией у мужчин. Были обнаружены структурные особенности провирусного генома и высокий уровень экспрессии провируса в быстро прогрессирующих опухолях молочной железы при РМЖАБ и в рецидивирующих листовидных опухолях. Впервые выявлены специфичные особенности структуры hMTV: нуклеотидные замены в сайте рибосомного фреймшифта и делеции в Sag-кодирующей области 3’LTR, которые могут обусловить неконтагиозность обнаруживаемых в человеческом молоке вирусных частиц за счет дефектного корового белка Gag и нарушения активации клеток-мишеней с участием вирусного суперантигена.

Впервые предложена экспериментальная модель: трансформированные MMTV клетки эпителия эмбриональной почки человека, позволяющая изучить интеграцию провируса в геном человека, его геномную структуру и экспрессию. С помощью экспериментальной клеточной модели и гибридизации in situ, а также ПЦР-анализа геномной ДНК из опухолевой и нормальной тканей доказана экзогенность hMTV для человека и способность эпителиальных клеток человека поддерживать вирусную инфекцию с последующей трансформацией этих клеток.

Впервые описана циркуляция hMTV в организме: экспрессирующиеся провирусные последовательности обнаружены в лимфоидных клетках периферической крови, в опухолевой ткани молочной железы, в отдаленных метастазах у больных РМЖ, в гиперплазированных лимфатических узлах и в костном мозге у некоторых больных гемобластозами.

Впервые сделана попытка многофакторного анализа носительства hMTV в ассоциации с мутациями в генах-супрессорах BRCA1/2 и TP53, экспрессией EsR, PrR и Her2/neu (по результатам иммуногистохимии).

Впервые предложен доступный метод детекции в плазме крови и опухолевых лизатах РМЖ продукта гена env hMTV, кодирующего аминокислотные мотивы в составе клеточных иммунорецепторов и играющего роль в трансформации эпителиальных клеток. Результаты позволяют обосновать роль экзогенного MMTV- родственного ретровируса (hMTV) в индукции и прогрессии РМЖ, и возможно, ряда других неоплазий (неходжкинских лимфом и ювенильного острого миелобластного лейкоза).


загрузка...