Иммунотерапия дифтерии (клинико-экспериментальное исследование) (23.01.2012)

Автор: Капустян Валерий Андреевич

В экспериментальных исследованиях использовали коммерческую лошадиную противодифтерийную сыворотку, очищенную методом пептического переваривания с активностью 1500-1900 МЕ/мл. С целью получения более точных результатов специфическая активность каждой использованной серии препарата была подтверждена в реакции нейтрализации токсина классическим методом Рёмера на морских свинках.

Соответствующие виду животных гомологичные гипериммунные сыворотки с активностью от 70 до 100 МЕ/мл получали путем гипериммунизации кроликов и морских свинок дифтерийным анатоксином по схеме.

В экспериментальных исследованиях использовали предварительно изученные дифтерийные токсины, применяемые в лаборатории анатоксинов и сывороток ГИСК им. Л.И. Тарасевича при контроле активности противодифтерийных сывороток и дифтерийного анатоксина.

Содержание антитоксина в исследуемых сыворотках крови больных и доноров определяли различными способами: в реакции пассивной гемагглютинации с коммерческим эритроцитарным антигенным диагностикумом, в реакциях нейтрализации токсина классическими методами Иенсена на кроликах и Рёмера на морских свинках.

Общее содержание Т- (CD3) и В- (CD22) лимфоцитов крови и субпопуляции Т - хеллеров (CD4) и Т-супрессоров (CD8), общее число лейкоцитов крови, лимфоциты, нейтрофилы, моноциты и эозинофилы определяли на проточном цитофлюориметре «FACScan» («Becton Dickinson», США) с использованием соответствующих моноклональных антител НЦП «МедБио Спектр» (Москва). Рассчитывался коэффициент CD4/CD8 (К 4/8).

Результаты исследования были статистически обработаны на персональном компьютере с применением пакета программ для статистической обработки Statistical Package for the Social Science for Windows 11.0.1. и представлены в виде средних значений и стандартного отклонения от средней величины. Достоверность разницы средних значений показателей определялась с помощью t-критерия Стьюдента. Корреляционная связь между величинами оценивалась с помощью параметрического коэффициента корреляции Пирсона. При небольшом числе наблюдений или несоответствии выборки закону нормального распределения достоверность различий определялась с помощью непараметрических критериев ранговой корреляции Кендалла и Спирмена.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка донорской антидифтерийной плазмы

Предварительно доноры были обследованы соответственно «Инструкции по медицинскому освидетельствованию доноров крови», утвержденной Министерством Здравоохранения СССР 17.10.1973 г., на отсутствие антител к ВИЧ, HBs-антигена, сифилиса, антител к вирусу гепатита С и проведен биохимический анализ крови.

Всего обследовано 1934 постоянных донора Станции переливания крови г.Москвы в возрасте 19 - 62 года. Мужчин было 1648, женщин - 286. Большинство обследованных составили мужчины молодого возраста.

Распределение обследованных по группам крови и резус-принадлежности соответствовало популяционным характеристикам: превалировали доноры с А(II) группой крови резус-отрицательной.

Подбор доноров антидифтерийной плазмы проводился методом скрининга - сплошного обследования доноров крови на наличие у них специфических противодифтерийных антител с последующим формированием перспективной группы.

Высокие титры антитоксических противодифтерийных антител были обнаружены в крови как мужчин, так и женщин. Частота встречаемости высоких уровней антител была одинаковой в обеих группах: среди мужчин лица с титрами 0,5 МЕ/мл и больше встречались в 5,1 % случаев, среди женщин - в 4,9 %.

Проведенное исследование показало, что среди доноров имеется группа лиц с высокой напряженностью противодифтерийного иммунитета, уровень которого позволяет использовать их в качестве доноров специфической противодифтерийной плазмы. Такую группу составляют лица с титром антитоксических противодифтерийных антител 0,5 МЕ/мл и выше. Высокие уровни антител против дифтерии были выявлены среди обследованных со всеми группами крови, что дает возможность использовать препарат в клинических условиях для лечения больных с любой групповой принадлежностью.

Заготавливалась лишь отвечающая всем стандартам плазма - прозрачная, золотисто - желтого цвета, без примеси эритроцитов, без мути и хлопьев.

Плазма тестировалась по всем параметрам, установленным для контроля препаратов человеческой крови - стерильность, прозрачность, отсутствие антител к ВИЧ, HBs-антигена и сифилиса, и хранилась до момента применения в замороженном виде при температуре -200С.

Через 1, 3 и 6 месяцев хранения были проведены контрольные определения титра антидифтерийных антител в предварительно заготовленных образцах плазмы, хранившихся, как указано выше. Снижения титра во всех отобранных в работу пробах не выявлено.

В процессе продолжительного наблюдения доноров выявлено, что доноры, привитые против дифтерии в одно и то же время по одинаковой схеме - согласно представленным документам из районных поликлиник - имеют различный уровень поствакцинального иммунитета.

Для изучения особенностей дифтерийного антителообразования были обследованы 2797 доноров в РПГА с дифтерийным эритроцитарным диагностикумом.

Группы крови определялись цоликлонами А и В, резус-принадлежность - желатиновым методом.

Лиц с О (I) группой крови было 33,8 %, А (II) - 36,2 %, В (III) - 22,0 % и АВ (IV) - 8,0 %. Резус-отрицательными были 87,8 % всех обследованных.

Содержание противодифтерийных антител в крови доноров в целом по группе составило 0,39+0,04 МЕ/мл. Наибольший уровень антител выявлялся при АВ (IV) группе (0,46+0,17 МЕ/мл), наименьший - при О (I) (0,34+0,05 МЕ/мл). У доноров, имеющих А-агглютиноген, уровень противодифтерийных антител составил 0,39+0,06 МЕ/мл, В-агглютиноген - 0,45+0,10 МЕ/мл. У резус-положительных доноров показатель равнялся 0,40+0,05 МЕ/мл, резус-отрицательных - 0,29+0,06 МЕ/мл. Различия между всеми показателями статистически недостоверны.

При анализе содержания противодифтерийных антител с учетом как группы крови, так и резус-принадлежности доноров, выявлены отчетливые закономерности. Наибольший уровень антител - 0,48+0,18 МЕ/мл - выявлен у резус-положительных доноров АВ (IV) группы, наименьший - 0,12+0,03 МЕ/мл - у резус-отрицательных доноров О (I) группы (р < 0,05). У доноров с содержанием антител 0,5 МЕ/мл и выше показатели еще более различались: уровень противодифтерийных антител в крови резус-положительных доноров АВ (IV) группы в 5 раз превосходил соответствующий показатель резус - отрицательных доноров О (I) группы (соответственно 3,89+1,44 МЕ/мл и 0,77+0,13 МЕ/мл; р < 0,05).

Таким образом, лица с генотипом, включающим одновременно оба аггглютиногена и резус-фактор, способны к более выраженному иммунному ответу на дифтерийный антиген.

Разработка донорского антидифтерийного иммуноглобулина

для внутримышечного введения

Всего обследовано 3418 постоянных донора Станции переливания крови г. Москвы, из них - 2871 мужчина и 547 женщин.

Высокий уровень антидифтерийных антител - в титре 1: 320 и выше (0,5 МЕ/мл и выше) - был выявлен у 7,0 % доноров всех групп крови.

Заготавливалась лишь отвечающая стандартам плазма - прозрачная, золотисто-желтого цвета, без примеси эритроцитов, без мути и хлопьев.

Плазма тестировалась по всем параметрам, установленным для контроля препаратов человеческой крови - стерильность, прозрачность, отсутствие антител к ВИЧ и вирусу гепатита С, HBs-антигена и сифилиса, и хранилась до момента применения в замороженном виде при температуре -20 0С.

Для создания пула (котловой смеси) отобрана плазма 238 доноров всех групп крови.

Для серии № 1 (загрузка № 1) было заготовлено 5660 мл венозной донорской плазмы. Содержание белка в плазме составило 5,6 %; рН сыворотки - 7,55.

Для серии № 2 (загрузка № 2) заготовлено 2000 мл венозной донорской плазмы. Содержание белка - 5,1 %; рН сыворотки - 7,3. Специфическая активность плазмы в РПГА составила 8 МЕ/мл, в реакции Ремера - 1-2 МЕ/мл.

Для серий № 3 и 3` (загрузка № 3) заготовлено 7000 мл венозной донорской плазмы. Содержание белка в плазме - 5,3 %; рН сыворотки - 7,35. Специфическая активность в РПГА - 2-4 МЕ/мл, в реакции Ремера - 1 МЕ/мл.

Исходное сырье отвечало всем требованиям и по другим параметрам.

Таким образом, в результате проведенной работы из трех закладок сырья были получены 3 экспериментальные серии иммуноглобулина антидифтерийного донорского.

Технология получения препарата полностью соответствовала регламентированным методам выделения специфических иммуноглобулинов из донорского сырья.

В настоящее время в стране таким методом является способ холодово-спиртовой экстракции иммуноглобулина по Кону. Указанный способ обеспечивает достаточно жесткие параметры технологического процесса, что минимизирует возможность контаминации конечного продукта бактериями и их токсинами.

Основной задачей было получение препарата из общего пула заготовленной плазмы с расчетом соответствующих объемов разноактивной плазмы. Второй задачей было выявить оптимальную методику удаления спирта из полуфабриката при получении антидифтерийной плазмы. В этой связи параллельно, из одной загрузки, были апробированы метод лиофильной сушки и метод диафильтрации. Таким образом удалось получить препараты с практически идентичной специфической активностью, стерильные и апирогенные, однако при применении диафильтрации уровень белка в препарате оказался выше, концентрация раствора хлорида натрия - ниже. Электрофоретический анализ состава препарата показал, что в итоге при диафильтрации препарат содержит значительно меньше димеров и полимеров молекул иммуноглобулина, что указывает на большую его структуросберегающую способность.

Сырье и все серии полученного препарата, как было подчеркнуто, оказались стерильными и апирогенными.


загрузка...