Комплекс молекулярно-генетических методов для мониторинга ВИЧ-инфекции (23.01.2012)

Автор: Богословская Елена Владимировна

3 этап - разработка методов детекции продуктов ПЦР;

4 этап - разработка количественных стандартов.

Для экстракции РНК ВИЧ из плазмы крови было разработано два «ручных» варианта пробоподготовки (один основан на методе сорбции НК на силикагеле, второй – на методике осаждения НК с помощью изопропанола) и один автоматический вариант с использованием прибора easyMAG, который позволяет не только увеличить производительность анализа, но и повысить чувствительность в 10 раз за счет возможности тестирования большого объема клинического материала, вплоть до 1 мл.

Эффективность работы выбранных праймеров (описанных в главе 1 диссертации) была проанализирована на панели образцов, содержащих ВИЧ 10 субтипов, в сравнении с двумя зарубежными коммерческими тест-системами (табл. 3).

Таблица 3.

Количественное определение РНК 10 субтипов ВИЧ-1 с помощью тест-системы «АмплиСенс ВИЧ Монитор» в сравнении с двумя коммерческими тест-системами

Субтипы ВИЧ-1 Концентрация РНК ВИЧ (копии/мл), измеренная с помощью трех тест-систем

«Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5» «LCx HIV RNA Quantitative assay» «АмплиСенс ВИЧ Монитор»

С 3,68x103 3,54х103 1,62х104

H 1,25x104 5,40х103 1,58х104

A 4,31x103 3,80х103 1,17х104

N 2,63x103 596 500

B 2,26x103 2,51х103 4,18х103

E 5,05x103 3,89х103 1,12х104

O - - -

D 2,81x103 6,68х103 1,47х104

G 4,82x103 3,36х103 2,46х103

F 5,08x103 5,12х103 5,96х103

Результаты оценивали, рассчитывая разницу lg (копий РНК/мл) между результатами, значимыми отличиями считали разницу в более чем 0,5 lg. Для большинства образцов, содержащих ВИЧ группы М (A, B, C, E, F, G, H) значимых отличий между результатами, полученными с помощью трех проанализированных тест-систем, выявлено не было.

Для проведения реакций обратной транскрипции (ОТ) и ПЦР было разработано два варианта одностадийной ОТ-ПЦР, отличающихся используемым ферментом обратной транскриптазой (AMV либо MLV).

Главной частью разработки количественных тестов является создание РНК-стандартов, в частности, положительных контрольных образцов (ПКО) и внутреннего контрольного образца (ВКО). Для создания РНК-стандартов, защищенных от действия РНКаз, было предложено два метода упаковки РНК: в ретровирусные частицы и РНК-фаги. Во все РНК-конструкции клонировали фрагмент гена gag ВИЧ-1, который был необходим для последующего определения концентрации РНК в созданных препаратах с помощью тест-системы «Amplicor HIV-1 Monitor» (Хоффманн-Ла Рош), поскольку используемые в данной тест-системе праймеры комплиментарны области gag генома ВИЧ.

В основе разработанных количественных тест-систем лежит подход, основанный на амплификации исследуемого образца в присутствии ВКО, который проходит через все этапы ПЦР-анализа и выполняет функцию количественного стандарта. При разработке ВКО была сконструирована последовательность, максимально похожая по нуклеотидному составу на анализируемый фрагмент генома ВИЧ. Для каждой из разработанных тест-систем была подобрана оптимальная концентрация ВКО, которая бы не конкурировала с исследуемой матрицей ВИЧ в ходе амплификации и детекции.

В результате было разработано две тест-системы с разным способом детекции продуктов амплификации: традиционная ПЦР с ГИФА-детекцией («АмплиСенс ВИЧ Монитор») и Real-Time ПЦР («АмплиСенс ВИЧ-Монитор-FRT»). Разработанные тест-системы не дублируют, а дополняют друг друга. Так, для работы с тест-системой, основанной на традиционной ПЦР с ГИФА-детекцией, не требуется закупка дорогостоящего оборудования, и поэтому она незаменима в небольших лабораториях. Тест-система, основанная на методе Real-Time ПЦР, позволяет увеличить возможности лаборатории в несколько раз, однако для работы с ней требуется соответствующий прибор. Поэтому данная тест-система предназначена для более крупных лабораторий. Кроме того, для работы с этой тест-системой предусмотрена автоматизация этапа пробоподготовки ПЦР-анализа, что упрощает работу крупных лабораторий.

??????¤?????????A????d?????A

???d?????Q

???d?????A

??????????

????¤??????¶

2В ходе Государственных испытаний тест-системы «АмплиСенс ВИЧ Монитор», которые проходили в ГИСК им. Л.А. Тарасевича, была продемонстрирована высокая корреляция количественных результатов (коэффициент корреляции составил 0,93; pv < 0,001), полученных с помощью разработанной тест-системы, и результатов, полученных с помощью наиболее активно используемой в мире тест-системы «Cobas Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5» (рис. 1).

Рис. 1. Корреляция результатов измерения вирусной нагрузки (в lg копий/мл) с помощью тест-систем «Cobas Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5» и «АмплиСенс ВИЧ Монитор».

По оси абсцисс: концентрация РНК ВИЧ (lg копий РНК/мл), измеренная с помощью тест-системы «Cobas Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5»; по оси ординат: концентрация РНК ВИЧ (lg копий РНК/мл), измеренная с помощью тест-системы «АмплиСенс ВИЧ Монитор».

Высокая степень совпадения результатов была также выявлена при тестировании международного стандарта и стандартного образца предприятия (разница не превышала 0,2 lg) (табл. 4).

Таблица 4.

Результаты измерения концентрации РНК ВИЧ в образцах международного стандарта и СОП РНК ВИЧ

Образцы Разведение Концентрация РНК ВИЧ (копии/мл), измеренная с помощью двух тест-систем

«АмплиСенс ВИЧ Монитор» «Cobas Amplicor HIV-1 Monitor»

Международный стандарт Исходное 35000 55000

1:10 6000 5600

1:100 < 500 417

СОП Исходное 38000 54000


загрузка...