Пути усовершенствования живой гриппозной вакцины и тактики ее применения при подготовке к пандемии (23.01.2009)

Автор: Дешева Юлия Андреевна

Целью настоящей работы являлась разработка теоретических и научно-практических основ для создания, оценки и применения живой гриппозной вакцины против пандемически опасных вирусов гриппа.

Задачи исследования:

Молекулярно-генетический анализ и сравнительная оценка на чувствительных моделях гриппозной инфекции (куриные эмбрионы, культура клеток MDCK, мыши, хорьки) безвредных для человека ХА штаммов вирусов гриппа А и В, полученных последовательным пассированием при пониженной температуре.

Характеристика фенотипических и генотипических свойств ХА штамма А/Москва/21/17/65(H2N2) для применения в качестве нового донора аттенуации или вакцинного штамма в случае возвращения в циркуляцию вирусов этого подтипа.

Секвенирование донора аттенуации В/СССР/60/69 и модификация метода рестрикционного анализа применительно к реассортантам на его основе для производства поливалентной ЖГВ.

Подготовка, характеристика и доклиническое исследование высокопродуктивных реассортантных штаммов на основе ХА донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2) с потенциально пандемическими вирусами гриппа различных подтипов вирусов гриппа: Н5, Н7, Н9.

Оценка в ограниченных клинических испытаниях безвредности, генетической стабильности и иммуногенности ЖГВ, разработанной с использованием модельного апатогенного птичьего вируса подтипа А(Н5N2).

Разработка оптимальной стратегии и тактики вакцинации с использованием ЖГВ в интерпандемический период и при подготовке к пандемии.

Научная новизна. Автором впервые применен реассортантный метод к созданию вакцинных штаммов «шифтовых» вариантов вирусов гриппа на основе отечественного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2) с использованием апатогенных вирусов гриппа птиц, что отражено в заявке на изобретение 118284 A1 (WO, 2007). Впервые определены условия и закономерности получения и апробации холодоадаптированных штаммов вирусов гриппа потенциально пандемических подтипов - Н5, Н7 и Н9.

Автором впервые разработана экспериментальная модель для доклинического изучения прививочных свойств холодоадаптированных реассортантных штаммов потенциально пандемических подтипов. В доклиническом и клиническом изучении впервые исследована роль различных серологических тестов (РТГА, реакция микронейтрализации, иммуноферментный анализ) в оценке иммунологической эффективности ЖГВ подтипа Н5. На экспериментальной модели впервые теоретически обоснованы схемы иммунизации живой гриппозной вакциной из реассортантного штамма A(Н5N2).

Впервые проведенное определение нуклеотидной последовательности и молекулярно-генетический анализ штаммов А/Москва/21/17/65(H2N2) и В/СССР/60/69 и позволили обосновать их применение в качестве доноров аттенуации для получения реассортантных вакцинных штаммов. Результаты секвенирования и рестриктазного картирования, выявившие целый ряд уникальных нуклеотидных замен в генах негликозилированных белков донора аттенуации В/СССР/60/69, указывают на единый генетический характер обеспечения холодовой адаптации вирусов гриппа А и В.

Теоретическая значимость проведенных исследований. Впервые разработана концепция создания реассортантной ЖГВ против вирусов гриппа, обладающих пандемическим потенциалом. Эта концепция основана на экспериментальных доказательствах безвредности, иммуногенности и протективной эффективности холодоадаптированных реассортантных штаммов, содержащих поверхностные антигены апатогенных птичьих вирусов, а также подтверждена данными о репродукции реассортантного штамма А(Н5N2) в носоглотке человека с формированием гуморальных и секреторных антител не только к вакцинному штамму, но и к высокопатогенным вирусам птичьего гриппа A(H5N1).

Получены новые фундаментальные данные о механизмах холодовой адаптации вирусов гриппа. Установлена связь изменений полимеразной субъединицы РВ2 с реализацией функции холодовой адаптации штамма А/Москва/21/17/65(H2N2).

Практическая значимость работы. Работа имеет большое народно-хозяйственное значение. В результате ее выполнения автором создана уникальная коллекция холодоадаптированных реассортантов потенциально пандемических подтипов вирусов гриппа А(H5N2), А(H7N3) и А(H9N2), которые депонированы в Государственной коллекции вирусов института вирусологии имени Д.И. Ивановского. Эти штаммы могут быть использованы для быстрой наработки вирусного материала при производстве пандемической ЖГВ, что является одним из направлений международной стратегии подготовки к пандемии.

Данные доклинических испытаний реассортантного штамма A/17/утка/Потсдам/86/92(H5N2) позволили разработать и утвердить программы 1 и 2 фазы клинических испытаний экспериментальной серии ЖГВ подтипа А(H5N2) «Орвакс», производства ФГУП НПО «Микроген» с целью создания модели для клинического изучения ЖГВ подтипа Н5. Суммарные данные доклинического и клинического изучения безвредности, иммуногенности и эффективности реассортантных штамма на основе апатогенного птичьего вируса гриппа А(H5N2) позволили разработать основы для апробации ЖГВ потенциально пандемического подтипа Н5.

На основании результатов клинических испытаний тривалентная ЖГВ, включающая реассортантные штаммы на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2), рекомендована для профилактики гриппа среди детей с трех лет и пожилых людей, страдающих хроническими заболеваниями. Таким образом, были расширены контингенты для применения ЖГВ как единого препарата с включением наиболее уязвимых групп (детей дошкольного возраста и пожилых, хронически больных людей) что в случае пандемии позволяет обеспечить наибольший охват прививками всех групп и категорий населения.

Разработанные автором реассортантные вакцинные штаммы современных эпидемических вирусов В/60/Йоханнесбург/99/50, А/17/Калифорния/04/71(H3N2), А/17/Висконсин/05/84(H3N2) использовались для производства ЖГВ, на их основе подготовлено 5 млн. доз вакцины.

Анализ нуклеотидной последовательности донора аттенуации В/СССР/60/69 и модификация ОТ-ПЦР рестрикционного анализа впервые позволили выполнять этим методом идентификацию внутренних и неструктурных белков реассортантных вакцинных штаммов вирусов гриппа В.

Положения, выносимые на защиту.

Холодовая адаптация штамма А/Москва/21/17/65(H2N2) связана с появлением в процессе пассирования при пониженной температуре множественных нуклеотидных замен в гене РВ2, приводящих к изменениям в структуре соответствующей полимеразной субъединицы. Свойства холодовой адаптации, аттенуации и генетической стабильности, присущие штамму А/Москва/21/17/65(H2N2), позволяют использовать его не только в качестве самостоятельного вакцинного штамма для иммунизации населения в случае возвращения в циркуляцию вируса гриппа А(H2N2), но и как потенциально новый донор аттенуации.

Методы классической генетической реассортации в куриных эмбрионах позволяют регулярно получать высокоурожайные реассортантные штаммы на основе ХА донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2) с использованием в качестве источника поверхностных антигенов апатогенных вирусов гриппа птиц потенциально пандемических подтипов.

Реассортантные штаммы апатогенных птичьих вирусов на основе донора А/Ленинград/134/17/57(H2N2) проявляют свойства температурочувствительности, холодовой адаптации и аттенуации в различных чувствительных моделях. Высокая степень аттенуации ХА реассортантов птичьих вирусов для кур вплоть до полной неспособности к репродукции, свидетельствуют о безопасности для птичьих хозяйств производства и использования подобных штаммов.

Использование ЖГВ может быть эффективным против высокопатогенных вирусов гриппа даже в случае неполного антигенного соответствия между вакцинным вирусом и инфекционным штаммом (экспериментальная модель). Тем не менее, вакцинация штаммом нового подтипа до наступления пандемии является нецелесообразной, так как в настоящее неизвестен вирус, который вызовет пандемию.

Прототип ЖГВ «Орвакс» подтипа A(H5N2) является безвредным, генетически стабильным препаратом и способен к репродукции в носоглотке человека. При оценке иммуногенности ЖГВ подтипа H5 показано, что сочетанное применение реакции торможения гемагглютинации и теста микронейтрализации в наибольшей степени удовлетворяет критериям чувствительности и специфичности (клиническое изучение).

Реассортантная ЖГВ на основе доноров аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2) и В/СССР/60/69 является безвредной и эффективной для всех групп населения, включая детей от 3-х лет и пожилых людей старше 65 лет, страдающих хроническими заболеваниями (клиническое изучение).

В случае появления нового пандемического штамма рекомендуется проведение двукратной прививки соответствующей моновакциной. Включение штамма нового антигенного подтипа в состав поливалентной живой гриппозной вакцины является нецелесообразным, так как его иммуногенность при этом снижается (экспериментальные данные).

Внедрение результатов работы. По теме работы получено 4 патента на изобретения. Подана 1 заявка на патент. Подготовлены методические рекомендации «Вакцинопрофилактика гриппа с помощью живой гриппозной вакцины среди лиц пожилого возраста». Внесены изменения в Фармакопейную Статью на «Вакцину гриппозную аллантоисную интраназальную живую сухую» ФСП 42-0504-4097-04.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на 4-й Международной конференции по проблемам гриппа (Крит, Греция, 2000), 1-й и 2-й Европейских конференциях по проблемам гриппа (Мальта, 2002, 2005), 2-м Международном симпозиуме по проблемам респираторных инфекций (Ла Романа, Доминиканская Республика, 2002), 2-й Международной конференции по ортомиксовирусам (Нью-Джерси, США, 2003), 5-й Международной конференции по проблемам гриппа (Окинава, Япония, 2003), 1-й Международной конференции по вирусным вакцинам (Лиссабон, Португалия, 2004), Первой всероссийской конференции «Вакцинология 04» (Москва, 2004), VIII и IX Всероссийских научных Форумах с международным участием имени академика В. И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2004, 2005), Международной научной конференции «Актуальные вирусные инфекции – теоретические и практические аспекты» (Санкт-Петербург, 2004), 4-й Международной конференции по проблемам птичьего гриппа (Лондон, 2006), 2-й Международной конференции по вирусным вакцинам (Вена, Австрия, 2006). 6-й Международной конференции по проблемам гриппа (Торонто, Канада, 2007), Заседании ВОЗ по вопросам подготовки к пандемии (Женева, Швейцария, 2007), 3-й Европейской конференции по проблемам гриппа (Виламоура, Португалия, 2008). Материалы работы также представлялись и обсуждались на заседаниях Отдела вирусологии НИИЭМ РАМН (2004 г., 2005 г.) и Центра по контролю заболеваемости США, Атланта, США (2001 г., 2004 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 77 печатных работ, в том числе 29 статей (20 - в журналах, рекомендованных ВАК), 4 патента, 1 научный обзор и 43 тезиса докладов общим объемом более 200 страниц.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 328 страницах текста, включая 61 таблицу и 20 рисунков; состоит из введения, трех глав обзора литературы, семи глав собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы, который содержит 485 источников, из них 98 отечественных и 387 – иностранных.

Личный вклад автора. Тема и план диссертации, ее основные идеи и содержание разработаны автором на основании многолетних (1998-2007 г.г.) исследований. Реассортантные штаммы апатогенных вирусов гриппа птиц A(Н5N2), А(H7N3) и A(Н9N2), а также реассортанты эпидемических вирусов гриппа А и В, подготовленные на основе ХА штаммов А/Москва/21/17/65(Н2N2) и В/СССР/60/69, получены, проанализированы и апробированы в доклинических исследованиях на животных (мыши, хорьки) лично автором. Автор принимала личное участие в клинических исследованиях в домах престарелых и детских садах Санкт-Петербурга и Ленинградской области, а также на базе Военного госпиталя № 1137. Во всех совместных исследованиях по теме диссертации, наряду с личным участием в их проведении, автору принадлежит участие в разработке программы исследований, а также анализ полученных данных. Все материалы, использованные в диссертационной работе, проанализированы и обобщены лично автором.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Вирусы. В работе были использованы штаммы вирусов гриппа из коллекции отдела вирусологии: ХА доноры аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2) и В/СССР/60/69; вакцинный штамм А/Москва/21/65(H2N2) и его ХА вариант А/Москва/21/17/65(H2N2), реассортантные штаммы современных эпидемических вирусов гриппа А и В. При разработке ЖГВ против пандемически опасных вирусов гриппа автором были подготовлены реассортантные штаммы на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2) с использованием в качестве источника поверхностных антигенов апатогенных вирусов гриппа птиц подтипов H5, H7, H9, полученных из Центра по контролю и предупреждению заболеваний США. Для заражения иммунизированных животных применяли высокопатогенные (ВП) вирусы гриппа птиц подтипа А(H5N1), выделенные в во время вспышек в различных регионах. Все эксперименты с ВП вирусами гриппа птиц проводились в лабораториях с условиями повышенного уровня биологической защиты (BSL-3+).

Все вирусы культивировали в 10-дневных развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ). ХА донорские и реассортантные штаммы инкубировали при 34?С 48-76 часов. Апатогенные и высокопатогенные штаммы вирусов гриппа птиц инкубировали при 37?С в течение 18-24 часов. Инфекционную активность вирусов определяли в РКЭ при оптимальной, повышенной до 40? и пониженной до 25?С температуре, 50% эмбриональную инфекционную дозу (ЭИД50) рассчитывали по методу Reed-Muench (1938). К числу температурочувствительных (имеющих ts-) фенотип относили вирусы, которые репродуцировались при повышенной до 40?С температуре на 5,0-6,0 lg ЭИД50 ниже по сравнению с оптимальной (RCT40). Если разница титров при оптимальной и пониженной до 25-26?С температуре (RCT25) не превышала 3,0-4,0 lg ЭИД 50, вирусы относили к ХА группе (са- фенотип).

Культура клеток. Использовали линию клеток MDCK (NBL-2), полученную из Центра по контролю и предупреждению заболеваний США (Атланта, Джорджия).

Получение реассортантов между вирусами «дикого» типа и ХА донорами аттенуации проводили в РКЭ по описанным методикам (Александрова, 1977).

Молекулярно-генетический анализ. Определение состава генома реассортантных вирусов выполняли с помощью ОТ-ПЦР-рестрикционного анализа (Klimov, Cox, 1993) или частичным секвенированием отдельных генов. Для идентификации генов HA и NA применяли полное секвенирование. Специфические праймеры были разработаны с помощью компьютерной программы SeqLab. Обработку электрофореграмм нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакета программ DNAstar (Madison, WI). Множественное выравнивание нуклеотидных и аминокислотных последовательностей генов различных вирусов гриппа человека и птиц, а также определение идентичности проводили с помощью программы GeneDoc, версия 2.6.002 (Nicholas, 1997). Для филогенетического анализа использовали компьютерную программу Mega, версия 2.1 (Kumar, 2001) с применением алгоритма минимальной эволюции.

Лабораторные животные. Самки мышей линии BALB/c в возрасте 10 недель (Jackson Laboratories, Bar Harbor, MA, USA), самцы мышей линии СВА в возрасте 12-14 недель (питомник Рапполово, Ленинградская область), куры породы белый Леггорн в возрасте 4-х недель, хорьки обоего пола в возрасте 4-х месяцев.

Репродукция вирусов в дыхательных путях мышей. Мышам под легкой анестезией вводили интраназально (и/н) 50 мкл аллантоисной жидкости с содержанием вируса 101-107 ЭИД50. Эвтаназию проводили согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ № 266 МЗ РФ от 19.06.2003).Титры вирусов определяли в легких и носовых ходах на 3-и сутки по показателям титрования суспензии органов в развивающихся куриных эмбрионах, начиная с разведения 1:10 для легких и 1:2 для носовых ходов. 50% мышиную инфекционную дозу (МИД50) и 50% летальную дозу (ЛД50) определяли по методу Reed-Muench (1938).

Реинфекция. Иммунизированных мышей инфицировали ВП вирусами птичьего гриппа А(H5N1) в летальных дозах. Летальность и снижение веса регистрировали в течение 14 дней. Концентрацию вируса в дыхательных путях и лимфоидной ткани (тимус) определяли на 3-й день после заражения по результатам титрования суспензии органов на РКЭ. Концентрацию вируса в головном мозге мышей определяли на 6-е сутки после инфекции.


загрузка...