Патоморфологический анализ карциносаркомы Walker 256: влияние общей гипертермии и противоопухолевых агентов (мелатонина и циклофосфана) на опухолевый рост (22.08.2011)

Автор: Овсянко Елена Владимировна

Изучить особенности гистоархитектоники опухолевого узла карциносаркомы Walker 256 и основные параметры опухолевого роста при модифицирующем воздействии общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина, применяемых изолированно или в сочетаниях друг с другом.

Изучить ультраструктурные особенности основных типов опухолевых клеток и эндотелиоцитов карциносаркомы Walker 256 при ее спонтанном развитии и при модифицирующем воздействии общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина, применяемых изолированно или в сочетаниях друг с другом.

Провести иммуногистохимическое изучение уровней экспрессии антиапоптотического и проапоптотических белков семейства Bcl-2 в карциносаркоме Walker 256 крыс в процессе спонтанного развития и после воздействия общей гипертермии, мелатонина, циклофосфана и их сочетаний.

Изучить динамику изменений содержания токоферола и ретинола в сыворотке крови крыс после трансплантации карциносаркомы Walker 256 и после воздействия общей гипертермии, мелатонина, циклофосфана и их сочетаний.

Изучить уровень антиоксидантной и проаксидантной активности сыворотки крови у крыс с трансплантированной карциносаркомой Walker 256 и после воздействия общей гипертермии, мелатонина, циклофосфана и их сочетаний.

Изучить динамику изменения уровня малонового диальдегида и диеновых конъюгатов в сыворотке крови крыс после трансплантации карциносаркомы Walker 256 и после воздействия общей гипертермии, мелатонина, циклофосфана и их сочетаний.

Научная новизна. Впервые проведен комплексный патоморфологический анализ опухолевого роста карциносаркомы Walker 256 при спонтанном развитии после трансплантации в мышцу бедра крыс и после модифицирующих воздействий общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина. Показано, что морфогенетический потенциал опухолевых клеток карциносаркомы Walker 256 проявляется в формировании псевдофолликулярных структур или пластов из эпителиоидных клеток с тяжами или скоплениями саркоматозных клеток между ними и в индукции неоангиогенеза. Впервые на основании электронно-микроскопического исследования установлено, что в карциносаркоме Walker 256 в ходе ее прогрессивного развития присутствуют опухолевые клетки 2 типов. Популяция опухолевых клеток каждого типа представлена пятью клеточными формами, отражающими последовательные стадии клеточной дифференцировки, представлены их ультраструктурные характеристики.

Впервые выявлены патоморфологические особенности модифицирующего влияния общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина на гистоархитектонику карциносаркомы Walker 256 и основные параметры опухолевого роста. Установлено, что данные виды воздействий, примененные изолированно или в сочетании друг с другом, оказывают разные по выраженности эффекты на процессы пролиферации, гибели и дифференцировки опухолевых клеток, а также их метастатическую активность. Впервые показано, что применение циклофосфана в качестве моноагента или в сочетании с общей гипертермией и мелатонином вызывает значительную транзиторную редукцию эпителиоидных клеток и изменение архитектоники опухолевого узла через 7 сут после воздействий с реверсией опухолевого фенотипа в последующем, но при значительном уменьшении объема опухолевого узла. При включении циклофосфана в схемы противоопухолевой терапии происходит значительное снижение частоты метастазов в регионарные лимфатические узлы; сочетанное использование циклофосфана с мелатонином и общей гипертермией полностью подавляет метастазирование.

Впервые установлено, что применение мелатонина в качестве моноагента или в сочетании с общей гипертермией усиливает структурированность опухолевого узла карциносаркомы Walker 256 с формированием обособленных псевдофолликулярных структур, разделенных соединительнотканными септами. В опухолевом узле преобладают клетки 2-го типа на 4-й и 5-й стадиях дифференцировки. Включение мелатонина в схемы противоопухолевой терапии приводит к снижению митотического индекса и усилению апоптоза опухолевых клеток, наиболее значительно в сочетании с циклофосфаном. Мелатонин в меньшей степени, чем циклофосфан, снижает метастатический потенциал карциносаркомы Walker 256.

Впервые показано, что общая гипертермия вызывает ускоренное развитие карциносаркомы Walker 256, проявляющееся в усилении инвазии в пограничные скелетные мышцы и увеличении объема опухолевого узла в 9,8 раза через 5 сут после трансплантации опухолевых клеток, обусловливает максимальную частоту (100%) метастазов в регионарные лимфатические узлы. Гистоархитектоника опухолевого узла после общей гипертермии существенно не изменяется, но происходит его разрыхление из-за выраженного отека и некротического распада. Сочетанное применение общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина вызывает значительное уменьшение объема опухолевого узла (в 18 раз), но способствует его фрагментации с образованием нескольких центров опухолевого роста.

Впервые определена экспрессия проапоптогенных и антиапоптогенного белка семейства Bcl-2 в динамике развития карциносаркомы Walker 256 и при воздействии общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина. Показано, что изолированное или сочетанное применение данных воздействий приводит к снижению экспрессии антиапоптотического белка Bcl-2 и усилению экспрессии проапоптотических белков Bax и Bad. Установлена отрицательная корреляционная связь между отношениями Bcl-2/Bax и Bcl-2/Bad, с одной стороны, и апоптотическим индексом, с другой, что позволяет считать изменение соотношений этих белков в клетках карциносаркомы Walker 256 одним из механизмов индукции апоптоза.

Впервые изучены показатели реакции перекисного окисления липидов, прооксидантной (ПОА) и антиоксидантной (АОА) активности сыворотки крови при спонтанном развитии карциносаркомы Walker 256 и при воздействии общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина. Установлено, что спонтанное развитие карциносаркомы Walker 256 сопровождается достоверным увеличением отношения ПОА/АОА сыворотки крови крыс, свидетельствующим о смещении баланса в системе «про-/антиоксиданты» в сторону прооксидантов и развитии окислительного стресса в организме животных. Общая гипертермия, а также ее сочетания с циклофосфаном и мелатонином приводят к разнонаправленным изменениям содержания продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови крыс с карциносаркомой Walker 256 как в сторону их понижения, так и повышения.

Теоретическая и практическая значимость. Получены новые знания о патоморфогенезе и основных параметрах опухолевого роста перевиваемой карциносаркомы Walker 256 при ее спонтанном росте и после изолированного и сочетанного воздействия общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина как физических и химических агентов с разными механизмами противоопухолевого действия. Выявленные особенности противоопухолевого эффекта общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина и их сочетаний имеют большое значение для разработки более эффективных схем терапии онкологических заболеваний.

Проведенное исследование показывает важность комплексного морфологического анализа спонтанного и модифицированного опухолевого роста в динамике для установления возможных мишеней противоопухолевой терапии и оценки ее эффективности.

Основные положения, выносимые на защиту:

Морфогенетический потенциал опухолевых клеток карциносаркомы Walker 256 проявляется в формировании псевдофолликулярных структур или пластов из эпителиоидных клеток с тяжами или скоплениями саркоматозных клеток между ними и в индукции неоангиогенеза. Опухолевые клетки характеризуются высоким митотическим индексом, низким апоптотическим индексом, высокой частотой метастазирования по гематогенному и лимфогенному типам в регионарные лимфатические узлы, способностью индуцировать неопластическую кахексию.

Общая гипертермия, циклофосфан и мелатонин, применяемые изолированно, вызывают разные по направленности изменения гистоархитектоники трансплантированной карциносаркомы Walker 256. При сочетанном применении каждого цитостатика с общей гипертермией характер изменений гистоархитектоники определяется цитотоксическими свойствами каждого из них. При сочетанном применении общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина изменения архитектоники опухолевого узла определяются цитотоксическими свойствами циклофосфана, а выраженность изменений – количеством сочетаний противоопухолевых воздействий.

Спонтанное развитие карциносаркомы Walker 256 сопровождается достоверным увеличением отношения ПОА/АОА сыворотки крови крыс, свидетельствующим о развитии окислительного стресса в организме животных. Общая гипертермия, а также ее сочетания с циклофосфаном и мелатонином приводят к разнонаправленным изменениям содержания продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови как в сторону их понижения, так и повышения.

Анализ основных параметров опухолевого роста карциносаркомы Walker 256 (митотического индекса, интенсивности некроза и апоптоза, степени дифференцировки, метастатического потенциала) и системных проявлений неопластического процесса (неопластической кахексии, выраженности оксидативного стресса) после изолированного и сочетанного применения общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина свидетельствует о том, что наибольшая эффективность терапии достигается при сочетанном применении физических и химических агентов с разными механизмами действия.

Апробация результатов исследования. Основные положения работы доложены и обсуждены на: Всероссийской конференции с международным участием «Молекулярная онкология» (Новосибирск, 2008); I Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (Новосибирск, 2009); XIV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2009); II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (Новосибирск, 2010); X Конгрессе Международной ассоциации морфологов «Функциональная морфология человека и животных» (Ярославль, 2010); IX Российско-Германской научно-практической конференции Форума им. Р.Коха и И.И.Мечникова «Новые горизонты: инновации и сотрудничество в медицине и здравоохранении» (Новосибирск, 2010), межлабораторной конференции в НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (Новосибирск, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 30 работ, из них 15 – в ведущих рецензируемых научных журналах, включенных в Перечень ВАК РФ для публикации результатов докторских диссертаций.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 295 страницах текста, иллюстрирована 76 таблицами и 180 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, четырех глав, включающих материал и методы, результаты собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы (445 источников, из которых 165 отечественных и 280 иностранных авторов).

Весь материал диссертации получен, собран, обработан и проанализирован лично автором.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Использован перевиваемый штамм опухоли Walker 256, поддерживаемый in vivo (лаборатория физиологической генетики Института цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск). Суспензию клеток перевиваемой карциносаркомы Walker 256 вводили крысам Вистар в мышцу задней части бедра в дозе 1*106 клеток в 0,1 мл изотонического раствора NaCl (Хегай И.И. и др., 2008; Jacobson M.D., 1996; Monte O. et al., 2005). Работу с животными проводили с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинской декларации.

Через 5 сут с момента перевивки опухоли, когда ее объем достигал 2,51±0,42 см3, животных разделяли на 12 групп с целью выявления особенностей опухолевого роста под влиянием ОГ и противоопухолевых агентов (табл. 1). Макроскопический анализ проводили с вычислением объема опухоли, размеры измеряли штангенциркулем в трех взаимно перпендикулярных направлениях.

ОГ воспроизводили в полном соответствии со «Способом экспериментального моделирования общей гипертермии у мелких лабораторных животных» (Ефремов А.В. и др., 2001). Предлагаемый способ предполагает разогревание экспериментальных животных в резервуаре универсального водного термостата BWT-U, предназначенного для точного поддержания установленной температуры в диапазоне от 25°С до 100°С в водяной бане, при погружении в горячую воду до уровня шеи. Конструкция предусматривает автоматическое поддержание температуры нагрева воды и равномерное перемешивание ее слоев, что позволяет считать в эксперименте температуру постоянной величиной. Преимущество моделирования ОГ в водной среде перед воздушной заключается в том, что осуществляется равномерное, глубокое и быстрое нагревание организма животного (Lesnicar H. et al., 1989).

Таблица 1. Характеристика подопытных групп животных

Экспериментальные группы Условия воздействия Количество животных в группах

1-я группа Интактные крысы Вистар 7

2-я группа Трансплантация клеток карциносаркомы Walker-256 в мышцу бедра («спонтанный» рост) 21

3-я группа «Интактные» крысы Вистар после воздействия мелатонином 21

4-я группа «Интактные» крысы Вистар после общей гипертермии 21

5-я группа «Интактные» крысы Вистар после воздействия циклофосфаном 21

6-я группа Трансплантация клеток карциносаркомы Walker-256 в мышцу бедра и воздействие общей гипертермии 21

7-я группа Трансплантация клеток карциносаркомы Walker-256 в мышцу бедра и воздействие общей гипертермии в сочетании с мелатонином 21

8-я группа Трансплантация клеток карциносаркомы Walker-256 в мышцу бедра и воздействие общей гипертермии в сочетании с циклофосфаном 21

9-я группа Трансплантация клеток карциносаркомы Walker-256 в мышцу бедра и воздействие общей гипертермии в сочетании с мелатонином и циклофосфаном 21

10-я группа Трансплантация клеток карциносаркомы Walker-256 в мышцу бедра и воздействие мелатонином 21

11-я группа Трансплантация клеток карциносаркомы Walker-256 в мышцу бедра и воздействие циклофосфаном 21


загрузка...