ФАКТОРЫ И УСЛОВИЯ, РЕГУЛИРУЮЩИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ БУККАЛЬНЫХ ЭПИТЕЛИОЦИТОВ И ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С CANDIDA ALBICANS (21.04.2015)

Автор: Лукова Ольга Алексеевна

Оценку естественной колонизации у пациентов, получавших иммуномодулирующие и антисептические препараты, проводили путем подсчёта общего количества бактериальных клеток, адгезированных на эпителиоцитах. Из суспензии буккальных эпителиоцитов готовили мазки, фиксировали метанолом (10 мин), окрашивали 0,25% водным раствором азура А (“Sigma”, USA). Индекс естественной колонизации оценивали по числу бактериальных клеток в пересчёте на один эпителиоцит (бакт/эп). Учитывали средний результат после подсчета 100 эпителиоцитов.

Блокаду NF-kB и внутриклеточных MAP-киназ ERK1/2 и p38 в буккальных эпителиоцитах проводили путем инкубации клеток с соответствующими ингибиторами. Для подавления активации NF-kB использовали ингибитор протеасом – ALLN, в качестве специфического ингибитора ERK1/2 применяли U0126, для блокады p38 MAP-киназы - SB203580 («Sigma», USA). Эпителиоциты (106 кл/мл) инкубировали с ALLN (100 мкл, 90 мин, 37°С) или ингибиторами MAP-киназ (20 (M, 1ч, 37°С). В контроле использовали интактные клетки (без добавления ингибитора).

Определение уровня сывороточных молекул IgE, IgG и sICAM-1 у пациентов проводили методом ИФА на спектрофотометре BIO-RAD-480 (USA). Кровь из локтевой вены отбирали утром натощак в объеме 5 мл, получали сыворотку путем центрифугирования (1000g, 20 мин, 4°С). Для определения уровня иммуноглобулинов и sICAM-1 использовали коммерческие тест-системы ЗАО «Вектор Бест» (Россия) и Bender MedSystems (Австрия).

Статистическую обработку осуществляли по общепринятой методике с использованием компьютерных программ Excel и Stadia. Данные представляли в виде группового среднего арифметического (М) и стандартной ошибки среднего (SEM). В качестве параметрического критерия использовали критерий Стьюдента, в качестве непараметрического - критерий Вилкоксона - Манна -Уитни. Различия между выборками считали достоверными при уровне значимости р<0,05. Взаимосвязь параметров оценивалась методом корреляционного анализа: вычисляли коэффициент ранговой корреляции Спирмена (rs). Силу корреляционной связи определяли по значению rs: ниже 0,3 считали слабой, от 0,3 до 0,7 – средней и от 0,7 до 1,0- сильной.

Результаты собственных исследований

В работе оценивали функциональную активность эпителиоцитов по способности клеток к адгезивным взаимодействиям с микробной тест-культурой (искусственная колонизация Сandida albicans in vitro), оральной микрофлорой (естественная колонизация), а также по уровню экспрессии toll-подобных рецепторов под воздействием различных факторов и при патологических процессах.

Влияние эндогенных и экзогенных факторов на адгезивность

эпителиоцитов в экспериментальных системах с C. albicans in vitro

Гормональные изменения, регулярно происходящие в организме женщины, влияют на функциональную активность эпителиоцитов (Coleman H., et al., 2001; Beagley K. еt al., 2003). Было проведено сравнение действия гормонов, регулирующих менструальный цикл и репродуктивную активность у женщин: ЛГ, прогестерон, ФСГ, эстрадиол, эстриол, тестостерон, ХГЧ - на возможность эпителиоцитов слизистых оболочек (буккальных, вагинальных) вступать в адгезивные контакты с C.albicans in vitro (табл.2).

Таблица 2

Влияние гормонов на адгезивные взаимодействия буккальных и вагинальных клеток с C. albicans при разных режимах обработки эпителиоцитов, М ± m

Гормоны Кратность изменения индекса искусственной колонизации эпителиоцитов (количество раз)

Обработка гормонами буккальных эпителиоцитов

до контакта

с C. albicans Обработка

гормонами буккальных эпителиоцитов

в процессе контакта

с C. albicans Обработка

гормонами вагинальных эпителиоцитов

до контакта

с C. albicans

ЛГ 1,31 ± 0,1 * ? 2,59 ± 0,1 * /** ? 1,28 ± 0,1 * ?

Прогестерон 1,26 ± 0,2 * ? 1,34 ± 0,1 * ? 1,17 ± 0,1 ?

ФСГ 0,90 ± 0,2 1,40 ± 0,1 1,11 ± 0,3

Эстрадиол 1,29 ± 0,2 * ? 1,60 ± 0,2 * ? 1,25 ± 0,2 * ?

Эстриол 1,40 ± 0,3 * ? 1,36 ± 0,3 * ? 1,61 ± 0,3 * ?

Тестостерон 1,29 ± 0,3 * ? 1,80 ± 0,2 * ? 1,27 ± 0,2 * ?

ХГЧ 1,42 ± 0,2 * ? 1,60 ± 0,3 * ? 1,38 ± 0,3 * ?

* - достоверность отличий относительно необработанных эпителиоцитов (контроль)

(р < 0,05)

** - достоверность отличий эпителиоцитов, обработанных гормонами во время контакта с C. albicans, относительно клеток, прединкубированных с гормонами до контакта с кандидами (р < 0,05)

? - увеличение, ? - снижение показателя

Эксперименты показали, что контакт буккальных клеток с эстрадиолом, эстриолом, тестостероном и ХГЧ снижал способность эпителиоцитов к взаимодействию с кандидами в 1,29 ± 0,2; 1,40 ± 0,3; 1,29 ± 0,3; 1,42 ± 0,2 раза соответственно (р<0,05). Напротив, обработка эпителиоцитов прогестероном и ЛГ усиливала способность буккальных клеток адгезировать C.albicans в 1,26 ± 0,2; в 1,31 ± 0,1 раз (р<0,05). Обработка эпителиоцитов ФСГ не приводила к изменению адгезивности клеток (р<0,05) (см. табл.2). Можно предположить, что высокий уровень прогестерона, характерный для беременных, обеспечивает повышенную готовность мукозальных эпителиоцитов к адгезивным взаимодействиям с кандидами. Это хорошо согласуется с исследованиями, указывающими на увеличении частоты вагинального кандидоза среди беременных женщин (Лебедева О.П. и соавт. 2006).

Эксперименты с вагинальными эпителиоцитами показали прямую сильную корреляцию - от 0,71 до 0,83 изменений адгезивности буккальных и вагинальных эпителиоцитах под влиянием гормонов (см. табл.2). Отсутствие различий в способности к контактным взаимодействиям с кандидами у эпителиоцитов разных биотопов позволило сделать вывод об однотипной реактивности мукозальных клеток. В связи с этим, последующие эксперименты выполняли только с буккальными эпителиоцитами.

В ряде экспериментов наблюдали усиления эффекта от гормонов, если последние были добавлены во время контакта эпителиоцитов с кандидами (см. табл.2). Это может означать, что контакт с микроорганизмом повышает чувствительность эпителиальных клеток к данным воздействиям.

Оценивали влияние цитокинов IL-1, IL-6, IL-8, TNF-?, IFN-? на способность буккальных эпителиоцитов адгезировать кандиды. IL-1, IL-6, IL-8 и TNF-? относятся к цитокинам, запускающим и поддерживающим воспалительную реакцию (Хаитов Р.М., и соавт., 2009), тогда как IFN-? обладает противовирусной противоопухолевой и иммунорегуляторной активностью (Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008) (табл.3).

Прединкубация эпителиальных клеток с IFN-? приводила к снижению адгезии в системе в 2,1 ± 0,3 раз (p<0,05). В то же время, обработка эпителиоцитов IL-1, TNF?, IL-6, IL-8 повышала адгезию C.albicans на буккальных клетках в 1,3 ± 0,1; 2,0 ± 0,2; 1,2± 0,1; 1,8 ± 0,5 раз соответственно по сравнению с контролем (p<0,05). Добавление провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-6, IL-8, TNF?) в ходе взаимодействия эпителиоцитов и кандид также приводило к увеличению индекса искусственной колонизации в 1,2-2,0 раза (см. табл.3). Таким образом, можно предположить, что патологические процессы на уровне слизистых оболочек, сопровождаемые синтезом большого количества провоспалительных цитокинов (Серебренникова С.Н., 2008), увеличивают восприимчивость эпителиальных клеток к микроорганизмам, таким как кандиды.

Было установлено, что прединкубация буккальных клеток с иммуномодулирующими препаратами и антисептиками, применяемыми для обработки слизистых оболочек, приводила к снижению адгезивности эпителиоцитов в отношении кандид в 1,2 - 2,1 раза (p<0,05) (табл.4). Во всех случаях, за исключением экспериментов с препаратом «Ликопид», эти изменения носили выраженный характер (p<0,05). Аналогично иммуномодулирующие препараты и антисептики действовали и на процесс взаимодействия буккальных эпителиоцитов с кандидами (см. табл.4), снижая восприимчивость эпителиоцитов к микроорганизмам.

Таблица 3

Влияние цитокинов на адгезивные взаимодействия буккальных клеток с C. albicans при разных режимах обработки эпителиоцитов, М ± m


загрузка...