ФАКТОРЫ И УСЛОВИЯ, РЕГУЛИРУЮЩИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ БУККАЛЬНЫХ ЭПИТЕЛИОЦИТОВ И ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С CANDIDA ALBICANS (21.04.2015)

Автор: Лукова Ольга Алексеевна

Впервые изучена динамика изменения уровня естественной колонизации буккальных эпителиоцитов у пациентов на фоне применения комплексной терапии с использованием иммуномодуляторов и оральных антисептиков.

Теоретическая и практическая значимость

Подтверждена высокая чувствительность и информативность экспериментальной модели «адгезия C. albicans на эпителиоцитах слизистых оболочек in vitro» для оценки реактивности рецепторного аппарата эпителиальных клеток в ответ на различные стимулы.

Показано, что эпителиоциты разных биотопов – буккальные и вагинальные клетки – однотипно меняют адгезивную активность в отношении кандид под действием половых гормонов in vitro.

Разработан способ изучения функциональной активности и реактивности буккальных эпителиоцитов по оценке экспрессии toll-подобных рецепторов методом проточной цитофлюориметрии.

На основе метода исследования естественной колонизации буккального эпителия разработан алгоритм оценки эффективности применения иммуномодуляторов и оральных антисептиков в комплексном лечении хронических патологий.

Внедрение результатов работы

Разработанные методы и алгоритмы используются в лабораторно-диагностической и научно-исследовательской работе Нижегородского филиала ФГБУ «Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии» Минздрава РФ и стоматологической поликлинике ГОУ ВПО НижГМА Минздрава РФ (г. Нижний Новгород).

Положения, выносимые на защиту

Гормоны, участвующие в обеспечении овуляции и поддержании состояния беременности (лютеинизирующий гормон, прогестерон) усиливают адгезивность эпителиоцитов слизистых оболочек в отношении C. albicans in vitro. Обработка эпителиоцитов иммуномодуляторами и оральными антисептиками in vitro снижает способность буккальных клеток адгезировать C. albicans.

Кандида-зависимая активация нуклеарного фактора kB в буккальных клетках усиливает контактное взаимодействие эпителиоцитов с C. albicans.

Экспрессия TLR-2 и TLR-4 на буккальных эпителиоцитах способна регулироваться микробными метаболитами и иммуномодуляторами, а также меняется при хроническом пародонтите.

Анализ изменения уровня естественной колонизации буккального эпителия может применяться в оценке эффективности терапевтических мероприятий с использованием иммуномодуляторов и оральных антисептиков у пациентов разных возрастных групп с хроническими патологиями (онихомикоз, микробная экзема, респираторные заболевания).

Апробация материалов диссертации

Диссертация апробировалась на расширенном заседании кафедры микробиологии и иммунологии ГБОУ ВПО НижГМА Минздрава РФ (г. Нижний Новгород) 20 февраля 2015 г; протокол № 8.

Основные результаты диссертации докладывались и обсуждались на: XI, XII, XVI научно-практических конференциях по медицинской микологии (Санкт-Петербург; 2008, 2009, 2013), 2-ом съезде Микологов России (Москва, 2008), Х международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Казань, 2009), 2-ом Международном конгрессе по пробиотикам (Санкт-Петербург, 2009), XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2010), всероссийской научно-практической конференции, посвященной 95-летию ФБУН ННИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной (Нижний Новгород, 2014), на III Санкт-Петербургском международном экологическом форуме «Инфекция и иммунитет» (Санкт-Петербург, 2014).

Публикации

По материалам диссертации опубликована 21 печатная работа, из них 3 – в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 131 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Диссертация иллюстрирована 27 таблицами и 39 рисунками. Библиографический указатель включает 185 источников литературы, в том числе 118 отечественных и 67 зарубежных авторов.

Вклад автора

Диссертация представляет собой обобщение результатов, полученных автором лично. Эксперименты на проточном цитофлюориметре выполнялись совместно с к.б.н. Кропотовым В.С. на базе ФГУ "Нижегородский НИИ детской гастроэнтерологии" Минздрава РФ. Оценка ряда лабораторных показателей у больных с микробной экземой и онихомикозом проводилась совместно с врачами ФГБУ «Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии» Минздрава РФ (Пышкина Е.И., к.м.н. Шебашова Н.В., к.м.н. Мишина Ю.В.). Работы по изучению уровня колонизационной резистентности полости рта у часто болеющих и здоровых детей проводились совместно с проф., д.м.н. Якубовой И.Ш., к.м.н. Поляшовой А.С. (на базе кафедры гигиены ГБОУ НижГМА Минздрава РФ).

Буккальный эпителий от больных пародонтитом был предоставлен зав. стоматологической поликлиникой ГБОУ ВПО НижГМА Минздрава РФ, к.м.н. Китаевой Е.В.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ И РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Материалы и методы исследования

В работе было исследовано свыше 1800 препаратов эпителиоцитов (буккальных и вагинальных) человека. Проведено 54 серии экспериментов с искусственной колонизацией кандид на эпителиоцитах. Естественная колонизация буккальных эпителиоцитов исследована у пациентов с онихомикозом (53 взрослых и 23 детей), у 52 больных микробной экземой, у часто болеющих детей (21 человек), а также у 57 здоровых доноров. Проведено свыше 200 анализов сыворотки 78 пациентов методом иммуноферментного анализа. Выполнено 17 серий экспериментов с использованием проточного цитофлюориметра BD FACS Canto II System with Fluidics Cart (6-color, blue/red, USA).

Буккальные эпителиоциты получали от доноров (мужчин и женщин 21-38 лет, а также детей и подростков 2-14 лет), утром, натощак, с внутренней поверхности щеки, дважды отмывали (40g, 5 мин) забуференным физиологическим раствором (ЗФР), готовили взвесь с концентрацией 106 кл/мл. Клетки вагинального эпителия получали от женщин 25-36 лет (на базе женской консультации №1, г. Нижний Новгород), готовили суспензию клеток в ЗФР в концентрации 106 кл/мл.

В работе использовали штаммы Candida аlbicans 601, Candida krusei 583, Candida glabrata 441, Staphylococcus aureus 5983, Enterococcus faecium 179/2, Escherichia coli 205 (lact+) из коллекций кафедры микробиологии и иммунологии ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия» Минздрава РФ. Культуру C. albicans получали в дрожжевой фазе на агаре Сабуро (HiMedia, Индия) (24 ч, 37(С). Посевы смывали, отмывали десятикратным объемом ЗФР и ресуспендировали в концентрации 107 кл/мл. Концентрацию клеток определяли с помощью денситометра DEN-1 (ООО «Biosan», Латвия).

Для получения микробных метаболитов кандиды выращивали на жидкой среде Сабуро (ННПЦ ГИП, Оболенск), бактерии – на бульоне TSB (Becton, Dickenson & Co, France, USA) (24ч, 37(С). Супернатанты отделяли от микробных клеток центрифугированием (2000g, 15мин) пропускали через стерильные бактериальные фильтры (диаметр пор 20 мкм; Corning, Germany).

Влияние эндогенных и экзогенных факторов на адгезивность эпителиальных клеток слизистых оболочек проводили с помощью экспериментальной модели «искусственная колонизация C.albicans на эпителиоцитах in vitro», разработанной ранее в нашей лаборатории (Махрова Т.В. и соавт., 2004). Эпителиоциты подвергали влиянию различных факторов: гормоны, цитокины, иммуномодулирующие и антисептические препараты, а также микробные метаболиты (табл.1). Эпителиальные клетки (буккальные или вагинальные) и активные субстанции смешивали в равных объемах (по 0,5 мл), инкубировали 30 мин при 37(С. В контрольных пробах вместо исследуемых факторов использовали ЗФР или среду для культивирования микроорганизмов. Контролем служили интактные эпителиоциты. На следующем этапе равные объемы (по 0,5 мл) взвеси эпителиоцитов и C.albicans 601 совместно инкубировали (30 мин, 37°С) в ЗФР, встряхивая каждые 5 мин. Эпителиоциты отмывали ЗФР от не прикрепившихся кандид (40g, 5 мин). Из осадка клеток готовили мазки, которые фиксировали метанолом и окрашивали 0,25% раствором азура А (“Sigma”, USA). Определяли индекс искусственной колонизации, т.е. среднее количество адгезированных кандид в пересчете на один эпителиоцит (микроскопировали 100 клеток). Каждая серия включала эксперименты с эпителиоцитами не менее 5 доноров.

Таблица 1

Факторы, используемые для воздействия на эпителиальные клетки in vitro

Экзогенные и эндогенные факторы

Гормоны Растворы гормонов в ЗФР: эстрадиол - 450 пмоль/л, прогестерон - 50 нмоль/л, ХГЧ - 500 МЕ/л, эстриол - 15 нг/мл, ЛГ- 100мМЕ/мл, ФСГ - 50 мМЕ/мл, тестостерон – 1,71 нмоль/л («Sigma», USA)

Цитокины Растворы цитокинов в ЗФР: IL-1 (10– 12 г/мл); IL-6 (10– 12 г/мл), IL-8 (10– 12г/мл); TNF? (10– 9г/мл), INF? (10– 9 г/мл) («Sigma», USA)

Микро-организмы Метаболиты C. albicans 601, C. krusei 583, C. glabrata 441 S. aureus 5983, E. faecium 179/2 , E. coli 205 (lact+)

Иммуно-модули-рующие препараты Ликопид® (1мг/мл; ЗАО «Пептек», Россия); Рибомунил® (0,15 мг/мл; Пьер Фабр Медикамент Продакшн», Франция); Полиоксидоний® (6мг/мл; ООО «НПО Петровакс Фарм», Россия); Иммунал® (8мг/мл; Лек, Словения); Деринат® (0,25% раствор; ЗАО ФП «Техномедсервис», Россия), Имудон® (5мг/мл; ОАО «Фармстандарт-Томскхимфарм», Россия); Гриппферон® (3000МЕ; ЗАО «Фирн М», Россия)

Антисеп-тические средства Ксидифон® (2% водный раствор; ФГУП «Мосхимфарм-препараты», Россия), Лизобакт® (таблетки сублингвальные; 1мг/мл лизоцима, АО «Босналек», Босния и Герцеговина), Лизоцим (таблетки сублингвальные, 7мг/таб.; «Биофит», Россия)

Уровень экспрессии toll-подобных рецепторов на буккальных эпителиоцитах и жизнеспособность клеток определяли методом проточной цитофлюориметрии. Эпителиальные клетки, ресуспендировали, пропускали через фильтры CellTricks (диаметр пор 100 мкм), затем инкубировали с исследуемыми субстанциями (гормоны, цитокины, иммуномодулирующие препараты, антисептики, микробные метаболиты) (30 мин, 37°С) (табл.1). Контролем служили интактные эпителиоциты. Затем, к эпителиальным клеткам (100 мкл) добавляли 10 мкл коктейля (смеси) антител для идентификации HYPERLINK "http://ru.wikipedia.org/wiki/TLR4" \o "TLR4" TLR-2 (CD282) (5мкл) и HYPERLINK "http://ru.wikipedia.org/wiki/TLR4" \o "TLR4" TLR-4 (CD284) (5мкл) (BD Pharmingen, USA), выдерживали в течение 15 минут. Оценивали экспрессию toll–подобных рецепторов на проточном цитофлюориметре BD FACS Canto II System with Fluidics Cart (6-color, blue/red, USA). Полученные результаты выражали в процентах как отношение числа клеток, презентирующих на своей поверхности TLR-2 или TLR-4 к общему числу клеток в популяции. В каждой серии экспериментов использовали пул буккальных эпителиоцитов, полученных от 5-6 здоровых доноров. В ряде экспериментов использовали эпителиоциты, полученные от больных пародонтитом. Эксперименты каждой серии ставили в трех повторах.

При определении жизнеспособности, к 100 мкл буккальных эпителиоцитов добавляли 20 мкл 7-AAD (BD Pharmingen, USA) и инкубировали 15 минут. Клетки с поврежденными мембранами (мертвые) способны окрашиваться 7-AAD в отличие от живых (Сырцова М.А.и соавт., 2014). В контрольный образец краситель не добавляли, с целью определения спонтанного окрашивания.


загрузка...