Закономерности развития стенки тонкой кишки и еe эпителиальной ткани крупного рогатого скота в онтогенезе (20.09.2010)

Автор: Романова Татьяна Алексеевна

3. Локализация и динамика содержания нуклеиновых кислот, нуклеопротеидов, белков и полисахаридов в клеточных дифферонах эпителиальной ткани по этапам развития.

4. Периодизация, этапность, критические фазы развития эпителиальной ткани и стенки органа в онтогенезе.

1.4. Научно-практическая значимость работы. Полученные данные расширяют имеющиеся в настоящее время сведения: о возрастных особенностях и закономерностях развития кишечной стенки тонкой кишки и ее структур у крупного рогатого скота черно-пестрой породы; о возрастной динамике закладки, формирования и дифференциации эпителиальной ткани стенки тонкой кишки и ее клеточных дифферонов; локализации нуклеиновых кислот, нуклеопротеидов, белковых и углеводных компонентов в клетках эпителиальной ткани стенки тонкой кишки на разных этапах развития. Полученные новые данные об особенностях морфогенеза стенки тонкой кишки и ее эпителиальной ткани представляют интерес для теоретических и прикладных разделов морфологии животных, биологии развития и практического животноводства.

1.5. Реализация результатов исследования. Материалы исследования используются в научных и учебных целях на кафедрах анатомии, гистологии, эмбриологии, физиологии и патологии: Мордовского, Брянского, Хакасского государственных университетов; Московской, Санкт-Петербургской, Казанской академий ветеринарной медицины; Барнаульского, Воронежского, Краснодарского, Омского, Оренбургского, Ставропольского, Саратовского аграрных университетов; Брянской, Бурятской, Ивановской, Костромской, Нижегородской, Самарской, Чувашской, Ульяновской сельскохозяйственных академий.

1.6. Апробация работы. Материалы диссертации доложены на: научной конференции «Возрастная, видовая и адаптационная морфология» (Улан-Удэ, 1992); XI съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Смоленск, 1992); Всероссийской научно-производственной конференции «Гигиена, ветсанитария и экология животноводства» (Чебоксары, 1994); Ш съезде анатомов, гистологов, эмбриологов РФ (Тюмень, 1994); I съезде ветеринарных врачей Республики Татарстан (Казань, 1995); научно-производственной конференции, посвященной памяти профессора А.А. Клишова (Санкт-Петербург, 1995); III конгрессе Международной ассоциации морфологов (Санкт-Петербург, 1996); Международном координационном совещании (Воронеж, 1997); Международной научной конференции, посвященной 70-летию образования зооинженерного факультета (Казань, 1997); Международной научной конференции, посвященной 40-летию института ветеринарной медицины БГАУ (Барнаул, 2002); Всероссийской научно-производственной конференции (Ульяновск, 2003); Международной конференции, посвященной 60-летию факультета ветеринарной медицины Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии (Ульяновск, 2003, 2009, 2010); Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 50-летию аграрного образования в Удмурдской Республике «Эффективность адаптивных технологий в животноводстве» (Ижевск, 2004); IХ научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов Мордовского государственного университета (Саранск, 2004); Всероссийской научно-практической конференции «Роль науки в развитии АПК» (Пенза, 2005); Международной научно-практической конференции «Достижения зоотехнической науки и практики – основы развития производства продукции животноводства» (Волгоград, 2005); IV Международной конференции, посвященной 100-летию академика РАСХН Н.А. Шманенкова «Актуальные проблемы в животноводстве» (Боровск, 2006); Международной научно-производственной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора И.А. Спирюхова (Пенза, 2007); ежегодных Огаревских чтениях: Естественные науки (Саранск, 1993–2009); ежегодных Республиканских научно-практических конференциях, посвященных памяти профессора С.А. Лапшина «Ресурсосберегающие экологически безопасные технологии получения сельскохозяйственной продукции» (Саранск, 2005–2010); Всероссийской научно-практической конференции «Достижения ветеринарной науки и практики» (Киров, 2008); Международной научно-практической конференции «Роль биологии и ветеринарной медицины в реализации национального проекта «Развитие АПК» (Оренбург, 2008); Международной научно-практической конференции «Достижения современной ветеринарной науки и практики в области охраны здоровья животных» (Краснодар, 2009); VI Всероссийском съезде АГЭ (Саратов, 2009); Х Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Ярославль, 2010).

1.7. Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 55 научных работах, в т.ч. в монографии: Тельцов Л.П., Романова Т.А., Музыка И.Г. «Развитие кишечной стенки тонкой кишки и ее эпителиальной ткани в онтогенезе» (2009) и 14 журналах, входящих в перечень изданий, рекомендованных ВАК. Частично материалы диссертационной работы использованы в монографиях: Тельцов Л.П., Ильин П.А., Столяров В.А. «Функциональная морфология тонкой кишки в эмбриогенезе» (1993); Тельцов Л.П., Здоровинин В.А., Красовитова О.В. «Функциональная морфология толстой кишки в эмбриогенезе» (2001).

1.8. Структура и объем диссертации. Работа изложена на 389 страницах компьютерного набора и включает введение, обзор литературы, материал и методы исследования, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения и список литературы, иллюстрирована 70 рисунками и 56 таблицами. Список использованных источников включает 356 источников, в т.ч. 49 иностранных.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проведены на 148 зародышах, эмбрионах и плодах в возрасте от 20 суток до рождения и на 130 телятах черно-пестрой породы от рождения до 18 месяцев. Сбор материала проводился в период убоя на мясокомбинате «Саранский», а от подопытных телят – в лаборатории «Гистофизиология» кафедры морфологии и физиологии животных Мордовского государственного университета им. Н.П. Огарева, куда доставлялись телята из различных хозяйств Республики Мордовия.

Материалом исследования служили двенадцатиперстная, тощая и подвздошная кишки (см. схему исследований). Отобранный материал фиксировали для гистологических, гистохимических и электронномикроскопических (ЭМИ) исследований. В качестве фиксаторов использовали 12 % раствор нейтрального формалина, жидкости Карнуа и Шабадаша. Уплотнение материала проводили путем замораживания и заливки в парафин (Ромейс, 1953; Pearse, 1962; Основы гист. техн., 1967; Lilli, 1969; Меркулов, 1969; Кононский, 1976; Семченко и соавт., 2006). При гисто – и цитологических исследованиях учитывалась возможность возникновения объективных и субъектив-

Схема исследований развития стенки тонкой кишки и ее эпителиальной ткани крупного рогатого скота в онтогенезе

ных артефактов (Войно-Ясенецкий, Жаботинский, 1970).

Изучение специфических возрастных особенностей строения стенки и составляющих ее оболочек двенадцатиперстной, тощей и подвздошной кишок проводили на срезах, полученных на роторном микротоме МПС–2. Морфометрию проводили путем измерения толщины: всей кишечной стенки со складками и кишечной стенки без складок; слизистой оболочки и ее подслизистой основы; высоты и ширины ворсинок; глубины и ширины крипт; выводили соотношения количества ворсинок и крипт на определенную единицу измерения (на 550 мкм длины слизистой оболочки). Измерения проводились с помощью окуляр–микрометра ОК–15.

Цитометрия энтероцитов двенадцатиперстной, тощей и подвздошной кишок проводилась путем измерения длинного и короткого диаметров ядра, высоты и ширины энтероцита на гистологических препаратах, окрашенных гематоксилин-эозином. На основе этих показаний вычислялось цитоплазменно–ядерное отношение (ЦЯО).

Митотическая активность (митотический индекс – МИ) и дегенеративные изменения (индекс апоптоза – ИА) определялись из 1000 энтероцитов (миллипроцентах, ‰). МИ и ИА энтероцитов изучались в разных участках: на вершине, боковых поверхностях, основания ворсинок и в области крипт. Одновременно выводилось суммарное отношение МИ и ИА ворсинок и крипт. Цифровые данные обрабатывались биометрическим методом исследования (Кононский, 1976), в необходимых случаях выводили коэффициент корреляции (? ).

Для электронномикроскопических исследований кусочки кишечной стенки отбирали из средней части двенадцатиперстной, тощей, подвздошной кишок. Фиксацию отобранного материал осуществляли погружением его в 2,5 % раствор глютарового альдегида на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,2) в течение 4 – 12 часов.

Для выявления нуклеиновых кислот использовали реакции по Браше с применением метилового зеленого и пиронина. Дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) выявляли реакцией по Фельгену?Розенбеку.

Для гистохимического выявления суммарных белков использовались реакции выявления суммарных белков методом Бонхега, основных и кислых белков – метод Микель – Кальво (Кононский, 1976).

Для дифференциального анализа углеводов использовали гистохимические особенности функциональных групп углеводных компонентов. Начальным этапом дифференциации углеводных компонентов является использование классических методов гистохимической идентификации гликопротеинов ШИК-реакцией, разработанной McManus (1946), а также Л. А. Шабадашем (1947). Контролем при проведении реакции на гликоген служили препараты, предварительно обработанные альфа?амилазой (Роскин, 1951). Гликолипиды исключались из реакции обработкой препарата хлороформом и абсолютным спиртом во время уплотнения материала. Гликозаминогликаны (ГАГ) выявлялись реакцией коллоидным железом – по Хейлу (пропись Виноградова, Черемных, 1957; Мюллера?Митина, 1966), основным коричневым – по Шубичу (Шубич, 1961), альциановым синим – по Стидмену и сульфатированием – по Елисееву (Осн. гист. техн., 1967). За основу дифференциального выявления углеводных соединений ГАГ протеогликанов в тканях была принята схема В.В. Виноградова (1971), а также рекомендации Э. Пирса (1962), Спайсера (1963), М.Г. Шубича с соавт. (1966, 1975, 1982), Лилли (1969), П.А. Ильина (1972), А. Кононского (1976), Л.П. Тельцова (1984, 1997).

Люминесцентномикроскопические исследования (ЛМИ) нуклеопротеидов и углеводов проводили на срезах, флюорохромированных в растворе акридинового оранжевого (АО) в разведении 1: 10000, приготовленном на цитратно-фосфатном буфере при рН 2,2, 3,0, 4,2, 5, 0, 7,0. Время подбирали экспериментально в интервале от 10 секунд до 10 минут. Интенсивность свечения суммарных компонентов обозначали в баллах и выводили флуоресцентно-микроскопический коэффициент (СФК). Для идентификации полинуклеопротеидов, белков, полисахаридов в клетках и тканях использовали рабочую схему, предложенную Л.П. Тельцовым (1997)

Активность щелочной фосфатазы определяли по Гомори в модификации Фрединсона и методом азосочетания с применением соли диазония-5-хлор-О-толуидин (Пирс, 1962). Для контроля использовали срезы, инкубированные нагреванием при + 90 0С в течение 5 мин.

Для объективного сопоставления результатов реакций при гистохимических исследованиях выводили средний гистохимический коэффициент (СГК) по 5-балльной системе с переводом на проценты (Тельцов, 1984). Цифровые данные обрабатывались биометрическими методами.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Развитие стенки тонкой кишки и ее эпителиальной ткани на раннем этапе (от 20 до 34 суток) внутриутробного периода

Стенка тонкой кишки эмбриона коровы 20-34-суточного возраста выстлана внутри однослойным, многорядным эпителием, а снаружи – кубическим, однослойным мезотелием. Всю центральную толщу стенки занимает слой мезенхимных клеток. На 30-34 сут в мезенхимном слое выявляются нервные и ретикулиновые волокна. В эти же сроки происходит формирование кругового слоя мышечной оболочки и кровеносных сосудов. Просвет тонкой кишки и толщина эпителиального слоя в зародышевый этап увеличивается от 40,94±1,15 до 46,38±2,06 мкм, а толщина всей стенки уменьшается от 210,32±8,44 до 163,92±8,96 мкм. Это происходит за счет уплотнения мезенхимного слоя в местах формирования кругового слоя мышечной оболочки (рис. 1).

В мезотелии, эпителиальном и мезенхимном слоях стенки тонкой кишки обнаруживаются клетки в стадии деления, интерфазные клетки на различных уровнях дифференциации и клетки в состоянии физиологической деструкции. Соотношение между ними в разных тканях кишечной стенки неодинаковое. В среднем, за исследуемый этап, наибольший процент у группы клеток, находящихся в стадии интерфазы: для эпителия – 98,0 %; мезотелия – 99,16 %; мезенхимы – 99,26 %. Процент делящихся клеток составляет соответственно – 1,55, 0,82, 0,57, а в состоянии деструкции – 0,45, 0,03, 0,08 соответственно. В возрастном аспекте количество митотически делящихся

клеток уменьшается, дегенерирующихся увеличивается, в то время как количество клеток в стадии интерфазы остается почти неизменным. Между митотически делящимися и дегенерирующими клетками устанавливается едва уловимая отрицательная коррелятивная зависимость. Для эпителия r = - 0,45, для мезенхимы – r = - 0,31, для мезотелия – r = - 0,18. Слабая тенденция к положительной зависимости по величине митотического индекса (МИ) наблюдается между эпителием и мезотелием у эмбрионов 20-25 сут. Коррелятивной зависимости между делящимися клетками эпителия и мезенхимными клетками подэпителиального рыхлого слоя и уплотненного слоя мезенхимы не обнаружено. Высокий МИ клеток уплотненного слоя мезенхимы косвенно указывает на возникновение нового формообразовательного очага в стенке тонкой кишки.

Гистологические, гистохимические, люминисцентомикроскопические и цитометрические исследования эпителия стенки тонкой кишки эмбриона коровы 20-34-суточного возраста показали, что в разных участках кишки клетки однородны. Эпителию тонкой кишки свойственно: многорядность и вертикальное перемещение клеток; формирование полярной дифференцировки цитоплазмы клеток; высокий МИ – от 15,8±0,03 до 14,8±0,03 ‰; снижение ЦЯО – от 3,02 до 2,82; различная реакция нуклеопротеидов, белков и углеводов в ядре и цитоплазме клеток в интерфазе и при делении; активная гликогенсинтезирующая функция эпителиоцитов и участие эпителиальных клеток стенки тонкой кишки в межуточном обмене.

Гистохимическими исследованиями на нуклеиновые кислоты и нуклеопротеиды установлено, что в кариоплазме интерфазных дифференцирующихся эпителиальных клеток ДНК и ДНП выявляются в виде гранулярных и нитевидных образований, которые распределены в ядре равномерно. Около ядрышка и ядерной оболочки гранулы ДНК и ДНП несколько крупнее и интенсивность реакции их выше, по сравнению с гранулами кариоплазмы. Крупные гранулы соединены с ядерной оболочкой нитями дезоксирибонуклеопротеидной природы. В митотически делящихся эпителиальных клетках ДНП и ДНК имеют закономерное расположение: в стадии профазы они выявляются в виде мелких гранул и нитей, расположенных диффузно по всей кариоплазме; к завершению профазы они сосредотачиваются в укрупненные нити и гранулы; в стадии метафазы в виде изогнутых палочек (хромосом); в стадии анафазы в виде нитевидных «клубочков» у полюсов клетки. В стадии телофазы ДНК и ДНП распределяются по кариоплазме в обратной последовательности в виде плотного, рыхлого «клубка» и диффузного рассредоточения. Для отмирающих клеток эпителия, или клеток, находящихся в состоянии физиологического апоптоза, характерными признаками являются пикноз ядер и просветление цитоплазмы, рексис ядер при незначительных изменениях окрашиваемости цитоплазмы и очень редко хроматолиз и кариолизис при увеличении ядра и повышении базофильности или оксифильности цитоплазмы. ДНП пикнотических ядер и кариорексиса интенсивно дает реакцию в виде крупных глыбок, в то время как при кариолизисе они утрачивают способность к окрашиванию.

РНК и РНП в цитоплазме эпителиальных клеток в стадии интерфазы дают реакцию гомогенно в виде мелкой зернистости. Под формирующейся щеточной каемкой они выявляются в виде крупных гранул, которые пиронинофильнее зерен остальной цитоплазмы. В кариоплазме РНК и РНП дают реакцию в виде слабой, едва заметной диффузной зернистости, а в ядрышке в виде крупных пиронинофильных гранул. У эмбрионов 30-34 сут. в апикальных участках цитоплазмы эпителиоцитов образуются мелкие вакуоли. Вокруг цитоплазматических вакуолей и перинуклеарно гранулы РНП крупнее и реакция интенсивнее.

Эпителиальные клетки кишечной стенки богаты основными и кислыми белками. Эти вещества интенсивнее дают реакцию в области формирующейся щеточной каемки, в экскретах полости кишки и в области базальной мембраны эпителия. Сульфгидрильные и дисульфидные группы белков выявляются в цитоплазме эпителиальных и в кариоплазме митотически делящихся клеток. Карбоксильные и аминогруппы белков в незначительном количестве обнаруживаются около оболочек ядра и цитоплазмы, базальной мембраны и в щеточной каемке эпителиоцита. С такой же интенсивностью дают реакцию они и в содержимом тонкой кишки. Белки эпителиоцитов люминесцируют оранжево-красным цветом. Наибольшей интенсивностью свечения они обладают при флюорохромировании АО при рН 7,0. Свечение цитоплазмы после контрольных реакций (с ДНК-азой, РНК-азой, с ТХУ кислотой, 10 % раствором хлорида натрия) и исчезновение его после обработки трипсином свидетельствует о наличии белков. Интенсивность свечения белков и белковых групп в цитоплазме эпителиоцитов тонкой кишки постепенно повышается.

В области формирующейся щеточной каемки эпителиоцита у эмбриона коровы 20-24 сут наблюдается активность (в виде следов) щелочной фосфатазы (ЩФ). Активность ферментов несколько повышается к 30-34-суточному возрасту. ЩФ является основным внутриклеточным ферментом межуточного обмена на раннем этапе эмбриогенеза. Поэтому обнаружение активности ЩФ в щеточной каемке может косвенно свидетельствовать об участии эпителиоцитов тонкой кишки в межуточном обмене.

В просвете кишечника выявляется светлое содержимое. ГХИ и ЛМИ в нем обнаруживаются нуклеопротеиды, общие белки, ?SН? и ?S?S?, – NН2?, ?СООН? группы белков, гликоген, протеогликаны, содержащие ГАГ типа ГК. Накопление связано с метаболическим обменом эпителиоцитов и их экскреторной функцией. Процессы всасывания и экскреции клеток сопровождаются формированием в цитоплазме МЭ различных по величине вакуолей, специализацией органоидов, увеличением активности ферментов в щеточной каемке. Выявление нуклеопротеидов в содержимом связано с гибелью эпителиоцитов и экструзией их в полость кишечника.

Эпителиоциты многорядного эпителия тонкой кишки содержат ШИК-позитивные крупные гранулы. Выявляются они и в просвете кишки. После обработки срезов ? – амилазой реакция ШИК-позитивных гранул исчезает. В цитоплазме эпителиоцитов реакцией по Хейлу обнаруживаются мелкие гранулы, а в области мембран и щеточной каемки реакция наблюдается в виде однородной гомогенной зернистости. «Слабое» и «сильное» метилирование подавляет реакцию по Хейлу, а деметилирование после «слабого» метилирования восстанавливает ее. ?- метахромазия (очень слабая) возникает при рН 5,0.

Стенка тонкой кишки и ее ткани в различных участках тонкой кишки построены и выполняют одинаковую функцию. Однако тонкая кишки, как орган, начинает отличаться от остальной кишечной трубки. Во-первых, она формирует первичную петлю и ее повороты. По строению она отличается от формирующихся зачатков туловищной кишки, которые формируют легкие, печень, поджелудочную железу. Во-вторых, в этом возрасте эпителий кишечника вступает в морфофункциональную дифференциацию и гистохимически отличается от эпителия провизорных органов – желточного мешка и аллантоиса. В-третьих, в кишечной стенке происходит закладка нервной и мышечной ткани, кровеносных капилляров, дифференцировка мезенхимы в рыхлую соединительную эмбриональную ткань. Поэтому возраст 28-34 сутки эмбриона является критической фазой для развития организма и его пищеварительной системы крупного рогатого скота черно-пестрой породы.

3.2. Развитие стенки тонкой кишки и ее эпителиальной ткани на среднем этапе (от 35 до 60 суток) внутриутробного периода

Стенка тонкой кишки предплода коровы представлена слизистой, мышечной и серозной оболочками. Толщина эпителия и всей слизистой оболочки кишечной стенки увеличивается: эпителий – от 46,38±2,06 до 76,24±2,6 мкм (Р < 0,05), слизистая оболочка – от 54,6±2,4 до 68,9±3,1 мкм. При относительном постоянстве диаметра поперечного сечения всей стенки происходит уменьшение толщины серозной (от 14,95±0,4 до 8,76±0,2 мкм) и мышечной (от 55,9±2,7 до 35,7±1,3 мкм) оболочек (рис. 2). В то время как просвет кишки постепенно увеличивается от 21,02±0,81 до 108,87±0,6 мкм. Особенно интенсивно возрастает толщина эпителия и просвет тонкой кишки у зародыша после 50-55-суточного возраста. Просвет кишки у зародышей 60-суточного возраста, по сравнению с 50-суточными, увеличивается в 1,8 раза.

У зародышей 40-45 сут в двенадцатиперстной кишке появляются эпителиальные выпячивания в полость кишки. Несколько позднее, начиная с 45-50 сут, подобные выпячивания обнаруживаются в тощей и подвздошной кишках. В двенадцатиперстной кишке эти выпячивания заполняют весь просвет кишечной полости и образуют эпителиальные «пробки». В тощей и подвздошной кишках остается небольшой просвет.

Под эпителиальными выпячиваниями граница становится неровной в результате вхождения подлежащей соединительной эмбриональной ткани и образуются эпителиально-соединительнотканные выросты слизистой оболочки. Непосредственно под базальной мембраной на вершине выпуклости обнаруживаются два или три кровеносных капилляра. Эпителиально-соединительнотканные выросты увеличиваются одновременно с увеличением просвета кишки. К 60-сут. возрасту они становятся похожими на кишечные «ворсинки». В двенадцатиперстной кишке высота их 216,0 ± 84,5 мкм и ширина – 258,0 ± 73,6 мкм, в тощей кишке высота и ширина соответственно – 202,4 ± 65,1 и 264,3 ± 56,2 мкм, в подвздошной – высота 184,7 ± 48,4 и ширина 232,0 ± 50,5 мкм, а на продольных срезах – они похожи на складки, длина их в двенадцатиперстной кишке достигает 337,7 ± 66,08 мкм, в тощей – 361,0 ± 84,5, в подвздошной – 280,0 ± 46,8 мкм.

Мышечная оболочка образует кольцевой и продольный слои. Толщина ее в целом уменьшается от 55,9 ± 2,7 до 35,7 ± 1,3 мкм (Р < 0,05), что связано с уплотнением оболочки. Вначале кольцевой слой формируется в двенадцатиперстной кишке (30–34 сут), затем – в тощей (36–40 сут) и в подвздошной (40–45 сут) кишках. Наибольшая толщина его наблюдается в области прикрепления брыжейки. Продольный слой мышечной оболочки формируется в двенадцатиперстной кишке, начиная с 50–60?суточного возраста. В тощей кишке этот слой мышечной оболочки закладывается на 55–65 и в подвздошной – на 60–70 сут. Подобная последовательность формирования мышечных слоев тонкой кишки отмечается многими исследователями у млекопитающих – лабораторных животных и человека (Смирнова, 1949; Масевичус, 1964; Корочкин, 1965; Савчук, 1971; Гладкий и др., 1974). Следовательно, закладка мышечных слоев тонкой кишки подчиняется проксимо-дистальному градиенту развития. В области прикрепления брыжейки развитие этих слоев протекает быстрее. Ретикулярные волокна мышечной оболочки формируют рыхлую сеть. У предплодов коров 45–60 сут в эту сеть вплетаются единичные коллагеновые волокна.


загрузка...