Синтетические аналоги природных олигопептидов и их использование в ветеринарной медицине (20.04.2009)

Автор: Трутаев Игорь Викторович

- система пероксидации липидов и состояние антиоксидантной защиты;

- гомеостаз глюкозы (интактное состояние, нагрузки).

4. Разработать показания к применению синтетических аналогов природных олигопептидов для повышения резистентности и улучшения продуктивного здоровья животных.

Научная новизна. Впервые в ветеринарной фармакологии поставлена и решена проблема комплексного многостороннего изучения синтетических олигопептидов для повышения резистентности и улучшения продуктивного здоровья животных. Показано, что тимоген, неоген, седатин на фоне низкой токсичности и относительно низкой органо-системной специфичности проявляют высокую защитную активность при изменяющихся условиях и неблагоприятных воздействиях внешней среды. Установлено, что препараты проявляют стресс-корректорное, актопротекторное, антигипоксическое и антитоксическое действие, стимулируют гемопоэз и клеточный иммунитет при их угнетении, что связано с нормализацией процессов пероксидации липидов, активизацией антиоксидантной защиты, сохраняют гомеостаза глюкозы в экстремальных условиях. Новизна исследований подтверждена патентом РФ и дипломом Президиума Россельхозакадемии «За лучшую завершенную научную разработку 2005 года».

Практическая значимость и реализация результатов. Показания к применению изученных синтетических олигопептидов для повышения резистентности и улучшения продуктивного здоровья крупного рогатого скота, свиней, пушных зверей, птиц использованы при разработке Наставления по применению седатина в ветеринарии (№ 13-5-2/1142 от 14.01.98). Полученные результаты вошли в методические рекомендации «Скрининг биостимулирующих и биоцидных веществ (адаптогены, бактерициды и другие препараты)» одобренных секцией патологии, фармакологии и терапии Россельхозакадемии (протокол №2 от 14.07.2006 г.) и «Синтетические аналоги природных олигопептидов и их использование в ветеринарии», одобренных секцией патологии, фармакологии и терапии Россельхозакадемии (протокол №2 от 15.05.2008 г.).

Апробация работы. Данные экспериментальных и клинических исследований, которые легли в основу диссертации, доложены и представлены на ежегодных отчётных сессиях института в 1995-2005 годах, заседаниях Ветфармбиосовета в 1995, 2001 годах, на международной научно-практичес-кой конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Авророва А.А. (Воронеж, 2006), международной научной конференции «Токсикозы животных и актуальные проблемы болезней молодняка» (Казань, 2006), юбилейной научно-практической конференции ветеринарных терапевтов и диагностов, посвященной 90-летию со дня рождения засл. деят. науки РСФСР, академика РАЕ, д. вет. н. Кабыша А.А. (Троицк, 2007), первом съезде ветеринарных фармакологов России (Воронеж, 2007), международной научно-практи-ческой конференции, посвященной 65-летию Ульяновской ГСХА (Ульяновск, 2008), международной научно-практической конференции, посвященной 125-летию ветеринарии Курской области (Курск, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 31 научная работа, в том числе 12 статей в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования РФ, 2 Методические рекомендации, 1 монография и 1 патент.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

- о низкой токсичности и относительной органо-системной индифферентности синтетических олигопептидов;

- об адаптогенном, стресс-корректорном действии препаратов;

- о защитном действии тимогена, неогена и седатина при эмоционально-физических и химических нагрузках, гипоксиях и интоксикациях;

- о регулирующем влиянии препаратов на систему пероксидация липидов - антиоксидантная защита (ПОЛ-АОЗ) и гомеостаз глюкозы при изменяющихся условиях и неблагоприятных воздействиях внешней среды.

- об эффективности применения синтетических олигопептидов для повышения резистентности и улучшения продуктивного здоровья сельскохозяйственных животных.

Объём и структура диссертации. Работа изложена на 338 страницах и включает введение, обзор литературы, материал, объем и методы исследований, результаты собственных исследований, их обсуждение, выводы, предложения, список литературы и приложения. Диссертационная работа проиллюстрирована 120 таблицами и 37 рисунками. Список литературы включает 626 источников, в том числе 235 на иностранных языках.

2. Материал, объём и методы ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проведены в 1994-2008 годах в отделе клинической биохимии по планам НИР ГНУ Всероссийского научно-исследователь-ского ветеринарного института патологии, фармакологии и терапии Россельхозакадемии в рамках государственной Программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса РФ по заданиям: «Разработать и внедрить промышленную систему мероприятий по повышению естественной резистентности у крупного рогатого скота, свиней, овец и птиц»

(№ гос. рег. 01860113278); «Изучить роль нарушений обменных процессов и снижения резистентности в возникновении патологии высокопродуктивных животных. Разработать методы и средства их прогнозирования и профилактики, диагностики и терапии» (№ гос. рег. 01940007587); «Разработать общую теорию патологии животных и на её основе создать экологически чистую систему ветеринарной защиты»(№ гос. рег. 01.9.90.0001257), «Разработать новые высокоэффективные средства и методы повышения общей резистентности и иммунного статуса крупного рогатого скота, свиней и птиц» (№ гос. рег. 150070.3666026906, 06.8.003.04).

В проведении ряда исследований принимали участие сотрудники ГНУ ВНИВИ патологии, фармакологии и терапии Долгополов В.Н., Ермакова Т.И., Федорова Н.М., Аргунов М.Н., Сулейманов С.М., Шушлебин В.И., Мещеряков Н.П., Бузлама С.В., Бузлама А.В., Максимова Л.И., которым автор выражает искреннюю признательность за оказанную помощь и плодотворное сотрудничество.

Экспериментальные и научно-производственные опыты проведены в соответствие с требованиями к врачебно-биологическому эксперименту по подбору аналогов, постановке контроля, соблюдению одинаковых условий кормления и содержания животных в период проведения работы и учёта результатов.

Клинические испытания препаратов, их производственная апробация и внедрение осуществлены на животноводческих предприятиях Воронежской, Белгородской, Липецкой и других областей Российской Федерации, а также Харьковской области Украины.

Скрининговые исследования выполнены в соответствии с Методическими рекомендациями «Скрининг биостимулирующих и биоцидных веществ (адаптогены, бактерициды и другие препараты)», 2006, авторским свидетельством на изобретение (1982) и патентом RU (2125261).

Токсикологическую оценку и органо-системное действие изучали в соответствии с «Руководством по доклиническому изучению новых лекарственных средств» (Москва, 2000).

Оценка адаптогенного спектра препаратов выполнена с использованием трёх групп экстремальных воздействий (физическая перегрузка, кислородная недостаточность и химическая интоксикация) на 14 моделях. Состояние «оксидативного стресса» моделировали путем введения 5,6-диоксиура-цил моногидрата (ДОУМГ, аллоксана), который восстанавливается в диалуровую кислоту, при аутоокислении которой образуется H2O2 и активные формы кислорода, которые запускают в клетке цепь свободнорадикальных реакций (Николаева М. И. с соавт.,1986). ДОУМГ вводили после 24-часового голодания однократно подкожно в дозе 130-150 мг/кг массы тела.

Критериями интегральной оценки активности препаратов при стрессе служили выживаемость животных, их выносливость при функциональных нагрузках, заболеваемость, сохранение здоровья и продуктивности в критических ситуациях.

С целью характеристики общего состояния животных при применении изучаемых олигопептидов определяли количество в крови эритроцитов, гемоглобина, СОЭ, лейкоцитов и тромбоцитов общепринятыми методами (Предтеченский В.Г., 1964; Кондрахин И.П. с соавт., 1983; Карпуть И.М., 1986); содержание в сыворотке крови общего белка (г/л) рефрактометрически (Филиппович Ю.В. с соавт., 1975); активности АлАТ, АсАТ и щелочной фосфатазы (мМ/л(ч) (Меньшиков В.В., 1973).

Оценку влияния олигопептидов на углеводный обмен проводили по показателям крови: гликоген, г/кг (Мильман Л.С. с соавт., 1974); глюкоза, мМ/л (Меньшиков В.В., 1971); лактат, мМ/л (Прохорова М.И. с соавт., 1965); пируват, мкМ/л (Бабаскин П.М, 1976); активность глюкозо-6-фосфатдегид-рогеназы, мкМ/л(мин (Вульфсон П.В. с соавт., 1979); лактатдегидрогеназы, мкМ/мин(мг белка (Пырков Я.Н. с соавт., 1970).

Состояние системы ПОЛ-АОЗ у животных определяли по показателям: содержание в крови конъюгированных диенов (ДК) в ед.опт.пл./мг липидов или в мкМ/л крови (Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г., 1977); малонового диальдегида (МДА) в мкМ/л крови (Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. 1977); содержание в сыворотке крови флуоресцирующих оснований Шиффа (ОШ) в усл.ед./мл сыворотки (Bidlack W.R., Tappel A.L., 1973; Malshet V.G., Tappel A.L., 1973); содержание в крови общих и небелковых SH-групп в мМ/л (Рубина Х.М., Романчук Л.А., 1961); содержание в сыворотке крови витамина Е в мкМ/л (Кисилевич Р.Ш., Скварко С.И., 1972), ферроксидазную активность церулоплазмина (ЦП) в сыворотке крови в мкМ бензохинона/л(мин (Антонов М.П. с соавт., 1985); активность супероксиддисмутазы (СОД) в эритроцитах в отн.ед./мг гемоглобина (Чумаков В.Н., Осинская Л.Ф., 1977), каталазы (КАТ) в крови в мМ Н2О2/л(мин (Королюк М.А. с соавт., 1988), пероксидазы (ПО) в усл.ед./л крови (Плешков Б.П., 1976), глутатионпероксидазы (ГПО2) в крови в мМ восстановленного глутатиона/л(мин (Кругликова Г.О., Штутман И.М., 1976), глутатионредуктазы (ГР) в крови в мМ окисленного глутатиона/л(мин (Кругликова Г.О., Штутман И.М., 1976); содержание НЭЖК в сыворотке крови в мкМ/л (Прохоров М.Ю. с соавт., 1977), в-липо-протеидов в мг% (Ледвина М., 1960), холестерина в мМ/л (Меньшиков В.В. с соавт., 1987).

Для характеристики состояния гуморального звена неспецифической иммунологической резистентности организма определяли: бактерицидную активность (%) сыворотки крови (Смирнова О.В., Кузьмина Т.А., 1966); лизоцимную (мкг/мл) (Бухарин О.В., Васильев Н.В., 1974), комплементарную (% гемолиза) активности сыворотки крови (Вагнер Г.Ф., 1966); содержание пропердина (г/л) с сыворотке крови (Томилка В.С., Старостин И.С., 1984).

В проведении экспериментальных и научно-производственных исследований использовали: инфузории Paramecium caudatum (36 опытов, с оценкой 3-х препаратов); мышей - белых беспородных самцов и самок с массой тела 20,0±2,0 г (n=1659); белых крыс беспородных и линии Wistar самцов и самок с массой тела 150,0±20,0 г (n=1780); кроликов обоего пола породы шиншилла с массой тела 1,1-2,0 кг (n=44); собак (n=6); коров, откормочных быков и телят чёрно-пёстрой породы (n=286); свиней крупной белой, украинской пород и помесей разного возраста и пола (n=463); кур и цыплят породы леггорн, линии хайсекс и др. (n=3450); норок, песцов и хорьков (n=12045).

Опыты на продуктивных животных проводили в производственных условиях содержания и кормления. При заболеваниях диагнозы ставили в соответствии с утверждёнными инструкциями и методическими указаниями с привлечением соответствующих специалистов и данных лабораторных исследований.

Кровь для исследований получали из хвоста, ярёмной, ушной вен, при декапитации, а внутренние органы или их фрагменты - при вскрытии животных.

Полученный цифровой материал обработан методами математической статистики принятыми в биологии и медицине (М.Л. Беленький, 1963; Г.Ф. Лакин, 1973; Е.В. Гублер, 1978 и др.) с использованием прикладной статистической программы “Statistica 5.0” (Stat Soft Inc., 1998) и электронных таблиц “Microsoft Excel” на РС «Pentium IV».

3. Собственные исследования

3.1. Общая фармако-токсикологическая характеристика синтетических олигопептидов

3.1.1. Опыты на Paramecium caudatum

Токсическое действие на одноклеточных оценено по двум параметрам: дозозависимому и временному. Тимоген и неоген в диапазоне доз от 0,001 до 1,0 мг/мл среды не оказывают влияния на жизнеспособность инфузорий. Седатин в дозе 1,0 мг/мл среды проявляет протистоцидный эффект.

Испытанные олигопептиды, независимо от аминокислотного состава и структуры молекулы способствуют повышению сопротивляемости клеток к мембраноповреждающему действию гипертонического раствора натрия хлорида. Установлены существенные различия между препаратами в зависимости от дозы. Тимоген и неоген по активности близки между собой, хотя последний по всем соответствующим дозам активнее своего аналога на 8,0-21,0%.

Седатин в дозах от 0,001 до 0,1 мг/мл, хотя и менее значительно, чем неоген, повышает сопротивляемость клеток к повреждению. Но в высокой концентрации (0,1 мг/мл) он её существенно, на 25,0 %, снижает. По сравнению с неогеном, разница составляет 86,7 %.

Изучаемые синтетические олигопептиды при добавлении в питательную среду оказывают выраженное стимулирующее влияние на скорость деления инфузорий, находящихся в экспоненциальной фазе роста. Препараты повышают интенсивность деления на 65,0-125,0 % по сравнению с контролем в зависимости от дозы. Оптимум у неогена и тимогена оказался в пределах 0,01-0,1 мг/мл, а у седатина 0,001- 0,01 мг/мл. В дозе 0,1 мг/мл и выше седатин вызывал угнетение роста на 40,0 %.

3.1.2. Характеристика токсического действия препаратов


загрузка...