Механизмы микроэволюции вируса клещевого энцефалита (20.04.2009)

Автор: Карганова Галина Григорьевна

Впервые изучены механизмы восстановления низкой аффинности связывания вирионов с ГАГ у мутантов ВКЭ с ГАГ-связывающим фенотипом. Впервые показано, что при репродукции вируса с ГАГ-связывающим фенотипом в клетках млекопитающих могут возникать варианты ВКЭ, способные вызывать все формы инфекции (инаппарантную, острую и персистентную).

В результате проделанной работы впервые в экспериментах на мышах охарактеризована инаппарантная форма КЭ, вызванной периферическим введением адаптированного к клещам варианта ВКЭ с ГАГ-связывающим фенотипом. При данной инфекции нет виремии, не выявляется вирус и вирусная РНК в центральной нервной системе (ЦНС), не выявляются антитела (АТ) к основному гликопротеину Е при синтезе в небольших количествах АТ к неструктурному белку NS1 и формируется длительный протективный иммунитет.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Настоящая работа является первым комплексным исследованием, позволяющим оценить поведение популяции переносимого клещами арбовируса при чередовании хозяев (клещ-млекопитающее). Для экспериментально полученных вариантов ВКЭ, имеющих селективное преимущество при размножении в клещах и млекопитающих, проведено сравнение геномов, свойств вирионов, характеристик репродукции в клетках, патогенетических характеристик и особенностей иммунного ответа в экспериментах на лабораторных мышах и показаны механизмы изменения структуры популяции ВКЭ при смене хозяина.

Выявлено, что адаптация ВКЭ к клещам может приводить к значительному изменению антигенной структуры белка Е. Это необходимо учитывать при разработке и применении вакцинных препаратов, а также при оценке природной изменчивости антигенной структуры ВКЭ.

Показано, что при переадаптации ВКЭ от клещей к млекопитающим в популяции вируса появляются варианты, различающиеся по патогенетическим характеристикам.

Накопленная информация показывает, что длительная циркуляция ВКЭ в организме клеща может приводить к селекции низковирулентных вариантов, обеспечивающих скрытую иммунизацию млекопитающих против вирулентного вируса без синтеза АТ к белку Е. Полученные данные следует учитывать при создании диагностических препаратов, при прогнозировании тяжести течения и исхода заболевания, а также при изучении уровня сероконверсии у людей и прокормителей.

Приведенные данные относятся к изучению механизмов микроэволюции ВКЭ и патогенеза при разных формах КЭ с учетом гетерогенности популяции, которое являются одним из приоритетных направлений фундаментальных исследований в области инфекционной патологии.

ВНЕДРЕНИЕ

Материалы исследований были использованы при составлении Санитарно-эпидемиологических правил 3.1.3.2352-07 «Профилактика клещевого вирусного энцефалита», включены в программу лекций на кафедре вирусологии биологического факультета МГУ им. М.И.Ломоносова.

Определена первая полная нуклеотидная последовательность генома штамма ВКЭ прибалтийской группы сибирского генотипа (GenBank http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank, № DQ486861).

Разработан корректный методический подход, позволяющий оценить наличие персистенции вируса в ЦНС (Вопросы вирусологии, 2006).

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

- на поверхности клеток существует два типа рецепторов для ВКЭ, обеспечивающих высоко- и низкоаффинное связывание вирионов;

- популяция ВКЭ испытывает разное селективное воздействие при репродукции в клещах и млекопитающих, адаптация ВКЭ к клещам связана с появлением мутаций в белке Е, повышающих аффинность связывания вирионов с гликозаминогликанами (ГАГ) на поверхности клетки, которые служат низкоаффинным рецептором для этого вируса;

- адаптированный к клещам вариант ВКЭ с ГАГ-связывающим фенотипом при периферическом введении лабораторным мышам вызывает инаппарантную инфекцию, которая характеризуется формированием длительного протективного иммунитета без выраженного синтеза антител (АТ) к основному вирусному гликопротеину Е;

- варианты одного штамма ВКЭ, полученные на разной стадии адаптации к клещам и переадаптации к млекопитающим, могут вызывать все формы КЭ: острую, инаппарантную и хроническую;

- ВКЭ может существовать в виде гетерогенной стабильной по составу популяции, содержащей варианты, обладающие селективным преимуществом при репродукции либо в клещах, либо в млекопитающих, соотношение которых в популяции меняется при чередовании хозяев в процессе циркуляции;

- при определенных условиях в популяции ВКЭ могут быстро (за один пассаж) возникать новые мутанты с более высокой приспособленностью к репродукции в данной системе, при этом скорость изменения генетической структуры популяции ВКЭ и разнообразие мутантов определяется характеристикой хозяина и наличием эффекта "бутылочного горлышка".

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Работа была апробирована на заседании межлабораторного Ученого совета ГУ ИПВЭ им. М.П.Чумакова РАМН 20 февраля 2009 года.

Материалы диссертации представлены на заседании Ученого совета ГУ ИПВЭ им. М.П.Чумакова РАМН (2007), на научной конференции, посвященной 90-летию со дня рождения М.П.Чумакова (Москва, 1999), на региональных научно-практических конференциях (Якутск, 2007; Красноярск, 2008; Пермь, 2008), на Всесоюзных и Всероссийских научно-практических конференциях (Иркутск, 1990; Алма-Ата, 1991; Ярославль, 1992; Ижевск, 1998; Новосибирск, 2002; Пермь, 2003; Самара, 2004; Красноярск, 2005), на Международных конференциях по арбовирусам и арбовирусным инфекциям (Москва, 1989), по проблемам инфекций в клинической медицине (Санкт-Петербург, 2002), по ликвидации и элиминации инфекционных болезней (Санкт-Петербург, 2003), по возникающим болезням и выживанию (IMED Вена-Австрия, 2007), на VIII и Х Международных конгрессах по вирусологии (Берлин-Германия, 1990; Иерусалим-Израиль, 1996), на III Совместном совещании европейского общества борьбы с вирусными заболеваниями и европейской группы по быстрой вирусной диагностике (Страсбург-Франция, 1991), на V Интернациональном симпозиуме по (+)РНК содержащим вирусам (Флорида, 1998), на IV Конгрессе Европейского общества по инфекционным болезням (ESEI Лиссабон-Португалия, 2007); на VIII Всероссийском съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002), и на IV Всероссийском съезде общества паразитологов (Санкт-Петербург, 2008); на расширенных пленумах проблемных комиссий по клещевым и другим вирусным энцефалитам (Москва, 2003) и арбовирусам (Астрахань, 2006), на Бюро Отделения профилактической медицины РАМН (Москва, 2008).

ПУБЛИКАЦИИ

По результатам работы опубликовано 14 статей в реферируемых научных журналах, из них 3 за рубежом, 1 монография и 10 статей в научных сборниках.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 385 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего 511 источников. Работа иллюстрирована 21 таблицей и 38 рисунками.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

МАТЕРИАЛЫ

Использованные в работе штаммы и варианты ВКЭ были любезно предоставлены в.н.с. ГУ ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН Т.И. Дживанян: штамм Софьин (выделен от больного в 1937 г. на Дальнем Востоке); штамм Рс (выделен до 1980 г.), штамм Абсеттаров (выделен от больного в Ленинградской области в 1951 г.), штамм ЭК-328 (выделен в 1972 году из клеща I.persulcatus в Эстонии), вариант 718/574, полученный в результате пассажей штамма Эк-328 через клещей Hyalomma marginatum marginatum. Все исследования были проведены с использованием перевиваемой культуры клеток почек эмбриона свиньи (СПЭВ) (Dzhivanyan et al., 1974).

Лабораторная культура клещей Hyalomma marginatum turanicum, Pomeranzev, 1946 была выведена от сытых самок, собранных в Ставропольском крае в 2004 г. Все работы по определению клещей, их содержанию и заражению были проведены в.н.с. ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН Л.А. Буренковой.

Эксперименты проводили на беспородных (б/п) мышах (6 г, филиал «Андреевка» ГУ НЦ биотехнологий РАМН) и мышах линии BALB/c (6 и 12 г, филиал «Столбовая» ГУ НЦ биотехнологий РАМН).

Гистологическое исследование головного мозга инфицированных ВКЭ мышей было выполнено к.б.н. ст.н.сотр. ГИСК им. Л.А. Тарасевича Н.В.Терешкиной.

В работе были использованы лошадиный (-глобулин против ВКЭ (НИИ вакцин и сывороток, г.Томск) и набор моноклональных антител к белку Е, предоставленный заместителем директора ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор» (Кольцово) В.Б.Локтевым.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

Особенности эволюции переносимых клещами флавивирусов

К началу данного исследования были известны полные геномы только для двух штаммов ВКЭ (Плетнев и др., 1989; Pletnev et al., 1990; Mandl et al., 1990, 1991). В настоящее время в Генбанке представлено 28 полных геномов для 25 штаммов этого вируса.

Был проведен филогенетический анализ с использованием известных полных геномов штаммов ВКЭ и переносимых клещом I. ricinus флавивирусов, вызывающих энцефаломиелиты у домашних животных (рис. 1). Вирусы разделились на две группы. В первую группу вошли 5 европейских штаммов ВКЭ в виде одной группы и вирусы шотландского энцефаломиелита овец (ШЭО), испанского энцефаломиелита овец (ИЭО), турецкого энцефаломиелита овец (ТЭО) и греческого энцефаломиелита коз (ГЭК). Для каждого из этих вирусов известен геном только для одного штамма. Вторая группа достоверно разделилась на несколько ветвей. Отдельную ветвь представляют штаммы, относящиеся к сибирскому генотипу, две отдельные ветви - иркутские штаммы 178-79 и 886-84, выделенные в 1979 и 1984 годах, соответственно, и отдельную ветвь формирует дальневосточный генотип вируса.

Дивергенция геномов штаммов внутри европейского генотипа до 3%, внутри дальневосточного - до 6,5%, и до 7,8% - у сибирского генотипа. Обращает на себя внимание, что штаммы, относящиеся к одному генотипу, очень близки между собой, несмотря на большую разницу во времени выделения.

Штаммы, относящиеся в сибирскому генотипу, почти равно удалены от европейского и дальневосточного на 17,1-18,2% и 16,3-17,29%, соответственно. Штамм ЭК-328, для которого нами была определена последовательность полного генома, принадлежит сибирскому подтипу и образует отдельную ветвь внутри него.

Штаммы 178-79 и 886-84 отличаются друг от друга на 13,2%, и на 12,2-14,3% от представителей ближайшего к ним дальневосточного генотипа. Эти отличия значительно больше, чем между штаммами внутри генотипов ВКЭ, и близки к уровню дивергенции европейского генотипа ВКЭ и вирусов ШЭО и ИЭО. Эти значения и данные филогенетического анализа свидетельствуют о том, что иркутские штаммы представляют собой два новых генотипа. Различия между дальневосточными и сибирскими штаммами превышают или на уровне различий между европейскими штаммами и вирусами ШЭО, ТЭО, ИЭО, ГЭК.


загрузка...