Цитогенетические реакции лиственных древесных  растений на стрессовые условия и перспективы их использования для оценки  генотоксичности окружающей среды  (19.10.2009)

Автор: Калаев Владислав Николаевич

Доля клеток с ядрышками типа кора-сердцевина с вакуолью, % 18,3 27,1

Доля клеток с 2-я ядрышками в ядре, % 2,2 3,4

Доля многоядрышковых клеток, % 2,6 4,0

Число пиков митотической активности в течение суток 3 (в 6, 12 и 22 часа по зимнему времени)

Максимальное число ядрышек в ядре 5

Таблица 4

Значения цитогенетических показателей семенного потомства дуба

черешчатого, используемые в качестве контроля при проведении

цитогенетического мониторинга среды

Показатель Значение, % 95 %-й доверительный интервал

Митотический индекс 13,5±0,6 [12,3 ; 14,7]

Митотический индекс, подсчитанный без учета профаз 3,6±0,2 [3,1 ; 4,1]

Патологии митоза 1,4±0,3 [0,8 ; 2,0]

Патологии митоза, подсчитанные без учета профаз 5,9±1,4 [3,0 ; 8,8]

Доля профаз 72,3±2,1 [67,9 ; 76,7]

Доля метафаз 13,9±1,1 [10,7 ; 16,2]

Доля анафаз-телофаз 13,7±1,4 [10,7 ; 16,7]

Встречаемость остаточного ядрышка на стадии метафазы 13,6±2,8 [7,8 ; 19,4]

Частота встречаемости клеток с двумя ядрышками в ядре 3,1±0,3 [2,4 ; 3,8]

В качестве контроля для цитогенетического мониторинга среды с использованием проростков желудей дуба черешчатого были выбраны результаты, полученные при цитологическом анализе клеток проростков, зафиксированных в 22 часа (табл. 4).

Для целей мониторинга с использованием в качестве тест-объекта березы повислой мы рекомендуем использовать контрольные данные, полученные именно в год исследований опытной территории, т.к. обычно деревья березы повислой плодоносят ежегодно и проблем со сбором семенного материала с экологически чистых территорий не возникает (у дуба плодоношение происходит не каждый год). Это позволит нивелировать возможную погодную компоненту при проведении такого рода исследований.

5.2. Математические модели суточных ритмов цитогенетических показателей семенного потомства древесных растений, произрастающих на территориях с различной антропогенной нагрузкой

Математическое моделирование позволяет прогнозировать циркадные ритмы цитогенетических показателей древесных растений. При анализе цитогенетических показателей возможно использовать различные регрессионные модели. Для математического описания суточных ритмов цитогенетических характеристик (митотической активности, патологических митозов, ядрышковых характеристик) дуба черешчатого и березы повислой мы предлагаем следующие формулы:

где N – степень полинома, j=1..M, где M – число точек наблюдения, ai – коэффициенты полинома, полученные в рамках метода наименьших квадратов, yj – значения экспериментально полученных цитогенетических показателей, xj – моменты времени, в которые проводится наблюдение, yn – значение прогнозируемого цитогенетического показателя, xn – момент времени, в который проводится прогноз. Значения коэффициентов определяются отдельно для каждого из цитогенетических показателей на основе метода наименьших квадратов.

Формула (1) универсальна и позволяет анализировать суточные ритмы практически любой сложности, формула (2) дает более точный результат в случаях зависимостей, где увеличение и уменьшение показателя в течение суток происходит не менее 3 раз. Для каждой из цитогенетических характеристик была подобрана полиномиальная модель и определены коэффициенты при независимых переменных.

Использование указанных подходов дает возможность по одному экспериментально полученному значению цитогенетического показателя проводить его расчет в любое заданное время суток. Метод позволяет значительно снизить как временные, так и финансовые затраты и решить проблему невозможности выявления суточного ритма из-за гибели особи при фиксации.

Кроме того, использование математических моделей ликвидирует или снижает влияние групповой компоненты в определении показателя (обычно в течение суток материал от нескольких сотен биообъектов фиксируют с определенным интервалом и рассчитывают среднее значение цитогенетических показателей в данный момент времени).

Используя адекватные уравнения, описывающие суточные колебания исследуемого показателя, возможно корректно сравнивать результаты исследований, выполненных на материале, зафиксированном в разное время суток.

На основании разработанных подходов и моделей были созданы 4 компьютерные программы.

5.3. Цитогенетические характеристики семенного потомства берёзы повислой в экологически безопасных условиях

Средние значения митотического индекса в корневой меристеме проростков берёзы повислой в экологически благоприятных условиях в разные годы изменялись незначительно, что может рассматриваться как свидетельство сохранения генетического гомеостаза популяции. Высокая канализированность процесса клеточного деления подтверждалась также отсутствием достоверных различий между долями клеток на стадиях профазы, метафазы и анафазы-телофазы митоза в течение всех лет исследования.

Невысокие значения частоты встречаемости патологических митозов, по-видимому, отражали уровень спонтанного мутационного процесса, что подтверждалось отсутствием влияния фактора года сбора семян на данный показатель. В спектре патологических митозов преобладали мосты. Появление остаточного ядрышка в митозе в нестрессовых условиях не имело чёткой закономерности и, возможно, связано с компенсаторным синтезом белка для поддержания нормального прохождения митоза в пики митотической активности.

Наибольшим колебаниям в течение всех лет исследования подвергались характеристики ядрышкового аппарата, что, по-видимому, отражает зависимость метаболических процессов, происходящих при прорастании семян, от условий, влияющих на качество семян при их формировании. Преобладали высокофункциональные ядрышки типа «кора-сердцевина», характерные для активной меристематической ткани. Так же отмечено присутствие вакуолизированных ядрышек типа «кора-сердцевина». Появление в ядрышке вакуоли свидетельствует о снижении его функциональной активности (Челидзе, 1988). Наибольшие площади поверхности наблюдались у вакуолизированных ядрышек типа «кора-сердцевина», и они статистически достоверно превышали таковой показатель у ядрышек типа «кора-сердцевина» (P<0,05). Увеличение площади поверхности ядрышек типа «кора-сердцевина с вакуолью», возможно, компенсировало их пониженную функциональную активность и отражало переходы между вакуолизированными и невакуолизированными ядрышками. Достоверных различий во встречаемости гетероморфных парных ядрышек в течение всех лет исследования не обнаружено. Средние суммарные площади поверхности гетероморфных ядрышек изменялись по годам более значительно, чем гомоморфных. В клетках с гетероморфными парными ядрышками размеры «большого» ядрышка превышали размеры «маленького» в 2,7 – 3,3 раза.

Таким образом, выявленная степень изменчивости цитогенетических показателей позволяет рекомендовать использование семян берёзы повислой, собранных в районе Биологического учебно-научного центра Воронежского госуниверситета «Веневитиново», в качестве контрольных для исследований, в частности, по цитогенетическому мониторингу.

5.4. Цитогенетические характеристики семенного потомства берёзы повислой в условиях антропогенного загрязнения

5.4.1. Цитогенетические характеристики семенного потомства берёзы повислой в условиях г. Воронеж

Было установлено, что в клетках корневой меристемы проростков семян берёзы повислой на антропогенно загрязнённых территориях наблюдалась значительная изменчивость средних величин цитогенетических характеристик, в то время как их пределы варьирования (95 %-й доверительный интервал) не отличались от контрольных (табл. 4).

В большинстве случаев достоверные различия MИ как с контрольными показателями, так и с показателями в других опытных районах отсутствовали, что можно связать с высокой резистентностью митотической активности к воздействию поллютантов. В некоторых случаях митотическая активность на опытных территориях достоверно превышала контрольные значения (P<0,05), что было обусловлено задержкой клеток на стадии анафазы-телофазы митоза или стимулирующим действием загрязнителей среды, не приводящим к изменению скорости прохождения клетками стадий митоза. Только в Советском и Коминтерновском районах в 2003 г. значения митотической активности (с учётом и без учёта профаз) были достоверно ниже контрольного (P<0,05), что возможно, обусловлено присутствием загрязнителей-ингибиторов митотической активности или сдвигом пика митозов на другие часы. Кроме того, анализ распределения клеток по стадиям митоза позволил установить, что в 2001 г. в Советском районе г. Воронеж наблюдалась задержка клеток на стадии профазы, а в Коминтерновском районе – на стадии метафазы.

На большинстве опытных территорий в течение всех лет исследования наблюдалось статистически достоверное превышение контрольных значений встречаемости патологических митозов (как с учётом, так и без учёта профазных клеток) (P<0,05), в то время как достоверные различия между опытными районами существовали не всегда, что можно объяснить сравнительно одинаковой их загрязненностью или инертностью этого показателя. Т.о., уровень патологических митозов мог оставаться постоянным в широком интервале уровней загрязнения за счёт изменчивости других показателей (например, ядрышковых характеристик). Обращает на себя внимание факт устойчивого сохранения высоких значений частоты патологических митозов в Советском районе г. Воронеж, который считается экологически благополучным.

Спектр патологических митозов на опытных территориях г. Воронеж был представлен отставанием хромосом в метакинезе и в анафазе, хромосомными мостами в ана- и телофазе, агглютинацией хромосом в метафазе, асимметричными митозами, полыми метафазами, трёхгрупповыми метафазами, многополюсными митозами. В 2001 г. отмечено появление микроядер и фрагментаций ядра во всех опытных районах г. Воронеж. Расширение спектра аномальных клеточных митозов можно объяснить значительным загрязнением атмосферного воздуха поллютантами по сравнению с контрольной территорией.


загрузка...