Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа: роль в регуляции энергетического обмена, индукции апоптоза и агрегации белков (19.01.2009)

Автор: Плетень Анатолий Петрович

На примере взаимодействия окисленной и модифицированной ГАФД с шаперонином показана возможная роль этого процесса в развитии нейродегенеративных заболеваний амилоидной природы. Правильный подбор лекарственных препаратов и продуктов питания, предупреждение воздействия ядовитых соединений, модифицирующих сульфгидрильные группы ГАФД, регулирование процесса окислительного стресса, профилактическое введение антиоксидантов должно препятствовать появлению поврежденных белков и исключать их блокирующее воздействие на шаперонин. На основании этих наблюдений могут быть предложены новые способы профилактики и лечения нейродегенеративных заболеваний (прежде всего профилактическое применение антиоксидантов).

Предложен принципиально новый подход для отбора антител, способных вызывать развивающуюся во времени инактивацию нативных форм ферментов. На основе этого метода могут быть получены новые типы ингибиторов ферментов, действие которых заключается в индукции конформационных перестроек, трансформирующих нативную конформацию белка в неактивную.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на совместных заседаниях отделов биокинетики и биохимии животной клетки НИИ Физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, а также на перечисленных ниже Всероссийских и международных конференциях: III съезд Биохимического общества РАН (Санкт-Петербург, 2002), Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2003), Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics (Kiev, 2003), I Международная конференция “Химия, структура и функция биомолекул» (Минск, 2004), Международная юбилейная конференция, посвященная 70-летию В.П.Скулачева «Российская биоэнергетика: от молекул к клетке» (Москва, 2005), International conference «Fundamentals and Application» dedicated to 250th anniversary of Moscow State University (St.Petersburg-Kizhiy-Valaam, 2005), International alumni seminar on “Biotechnology and Health” (Erevan, 2005, 2008), II Международная конференция “Химия, структура и функция биомолекул» (Минск, 2006), VI симпозиум «Химия протеолитических ферментов», посвященного памяти В.К.Антонова (Москва, 2007), IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), Научно-практической конференции «Пищевая и морская биотехнология. Проблемы и перспективы» (Светлогорск, 2008).

По материалам диссертации опубликовано 35 печатных работ. Опубликованные в ведущих рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ – 9 публикаций, другие издания - 8 публикаций, материалы научных конференций - 18 публикаций.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (429 ссылок). Объем работы составляет 375 страниц, содержит 60 рисунков и 6 таблиц.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу Bacillus stearothermophilus выделяли из штамма-суперпродуцента Escherichia coli GM-109. Данный штамм был трансформирован мультикопийной плазмидой pskBstII, содержащий ген ГАФД из B.st. Плазмида была любезно предоставлена проф. Ги Бранлантом из Университета Пуанкаре (г. Нанси, Франция). Выделение проводили согласно методике Ройтел и соавторов (Roitel O. et al., 1999). Мутантные формы ГАФД B.stearothermophilus из клеток E. coli штамма GM-109, трансформированных плазмидой psk II B. stearothermophilus, выделяли по той же методике.

Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу из скелетных мышц кролика выделяли по методике Хилла (Hill C.M. et al., 1975).

Нефосфорилирующую глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (ГАПН) Streptococcus mutans из штамма E.coli DH5(, трансформированного мультикопийной плазмидой pskBstII, несущей ген ГАПН S. mutans, проводили по методу Кроу и Виттенбергера (Crow and Wittenberger, 1979).

Шаперонин GroEL из клеток E.coli штамма W3110, трансформированной плазмидой рОF39, содержащей ген GroEL проводили по методике Корралеса и Фершта с некоторыми модификациями (Corrales, Fersht, 1996). Плазмида, содержащая ген GroEL, была любезно предоставлена проф. В.В. Месянжиновым (ИБОХ РАН).

Моноклональные антитела клона 6С5 против ненативных форм ГАФД были получены нами ранее совместно с А. Г. Катрухой.

3-фосфоглицераткиназу, 3-фосфоглицератмутазу и енолазу выделяли из мышц кролика по методу Скоупса (Scopes, Stoter, 1982).

Ренин из почек выделяли по описанной нами методике с применением ионообменной и аффинной хроматографии на иммобилизованном пепстатине (Плетень и др., 1979).

Выделение протаминов, а также их дополнительная очистка до электрофоретически гомогенного состояния, определение аминокислотного состава и др. физико-химических свойств были проведены по описанной нами ранее методике (Исаева и др., 1989). В этой работе был использован только один из препаратов – протамин из лососевых рыб («сальмин»), представляющий собой монопротамин, содержащий в своем составе только одну основную аминокислоту – аргинин.

Концентрацию белка определяли методом Бредфорд (Bradford M., 1976) и спектрофотометрически по поглощению при длине волны 280 нм (А0,1%280 холоГАФД B.st.=0,92, апоГАФД B.st.=0,83, холоГАФДк =1,0, апоГАФДк =0,83, IgG =1,5).

Концентрацию иммобилизованных белков определяли по модифицированному методу Бредфорд (Asryants R. et al., 1985).

Определение дегидрогеназной активности ГАФД проводили спектрофотометрически по увеличению поглощения NADH.

Ацилфосфатазную активность окисленной ГАФД определяли спектрофотометрически по накоплению NADH в сопряженной системе с восстановленной ГАФД по методике Шмальгаузен и др. (Schmalhausen E.V., 1999).

Иммобилизацию белков проводили по методике, разработанной ранее в нашей лаборатории (Cherednikova T. et al., 1980). Степень активации носителя составляла 5-10 мг BrCN/г влажной сефарозы для иммобилизации ГАФД за одну субъединицу, 30 мг BrCN/г сефарозы для иммобилизации ГАФД за две субъединицы или для иммобилизации GroEL.

Получение иммобилизованных форм ГАФД различной нативности и степени олигомерности проводили в соответствии с описанными ранее подходами (Муронец и др., 1980, Cherednikova T. et al., 1980). Иммобилизованные на Cефарозе активные димеры ГАФД из мышц кролика и B. Stearothermophilus получали после диссоциации иммобилизованного активного тетрамера на свободный и связанный с матрицей димеры. Неактивный тетрамер получали обработкой иммобилизованного тетрамера глутаровым альдегидом. Для получения иммобилизованной денатурированной ГАФД тетрамеры, связанные с матрицей через одну субъединицу, денатурировали до полной инактивации фермента в 8 М мочевине или в буфере c рН 2,3.

Иммунизацию кроликов проводили согласно стандартной процедуре (Green J. and Manson M., 1998), используя для иммунизации 2 мл эмульсии, содержащей 1т мл полного адъюванта Фрейнда, 0,5-0,8 мг ГАФД B. stearothermophilus и 0,8 мг GroEL. Это позволило выделить из сыворотки крови одного животного антитела против двух антигенов.

Выделение антител на иммобилизованных антигенах. Фракцию иммуноглобулинов G, полученную из поликлональной сыворотки, наносили на сорбенты с различными иммобилизованными антигенами и инкубировали в течение 30-40 минут. Не связавшиеся с иммуносорбентом антитела собирали, а сефарозу промывали буферным раствором. Низкоспецифичные антитела элюировали буферным раствором с рН 4,3. Высокоаффинные антитела элюировали буферным раствором с рН 2,3. Полученные антитела немедленно нейтрализовали двукратным объемом фосфатного буферного раствора (рН 7,7), замораживали и хранили при температуре -20(С.

Титр антител на ГАФД и GroEL в сыворотке определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа ELISA по классической процедуре непрямого иммуноферментного анализа (Barh G.M. et al., 1980). Степень перекрестной реакции между антителами определяли с помощью метода иммунопреципитации с Protein G. ГАФД инкубировали с эквимолярным количеством антител в течение 20 мин, а затем добавляли иммобилизованный Protein G. После 40 мин инкубации сефарозу промывали и состав проб анализировали ДСН-электрофорезом. Анализ интенсивности белковых полос проводили с помощью компьютерной программы PCBAS 2.08.

Электрофорез в денатурирующих условиях в полиакриламидном геле в присутствии ДСН, а также нативный электрофорез и иммуноблоттинг проводили с соответствии со стандартными процедурами.

Введение ([32P]dATP в ДНК с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I. ДНК метили с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I с добавлением случайных гексануклеотидов и ([32P]dAТФ согласно стандартной методике (Маниатис Т. и др., 1984).

Связывание ГАФД с мечеными ДНК и РНК. Апоформу ГАФД кролика получали с помощью аффинной хроматографии на колонке с Affi-blue сефарозой. АпоГАФД подвергали окислению Н2О2. Окисленный и восстановленный апоферменты затем инкубировали с ДНК или РНК в присутствии кофакторов (NAD или NADH) или без них. Затем проводили фильтрацию смеси через нитроцеллюлозные фильтры (0,45 (m, Millipore HA), промывку фильтров и измерение радиоактивности во всех пробах (Wong I. and Lohman T.M., 1993)

Изучение субклеточной локализации ГАФД в клетках HeLa в процессе апоптоза. Клетки HeLa и HeLa-Bcl-2 выращивали на среде Eagle (Rovensky Y.A. et al., 1999). В апоптоз клетки вводили одновременным добавлением TNF-( и ингибитора синтеза белка (эметина) в количестве 1 мкг/мл среды. Перекисный апоптоз индуцировали добавлением в культуральную среду раствора перекиси водорода до конечной концентрации 10 мкМ. Культуру клеток HeLa и HeLa-Bcl-2 выращивали в течение двух дней и фиксировали 4% раствором формальдегида. Актиновые микрофиламенты окрашивали флуоресцентным красителем родамин-фаллоидином. ГАФД окрашивали с помощью моноклональных антител клона 6С5. Клетки исследовали и фотографировали с помощью микроскопа Axiophot (Carl Zeiss, Germany) и объективов (Apochromat, Germany) с 40 – и 60 – кратным увеличением, а также конфокального лазерного микроскопа LSM-510 (Carl Zeiss, Germany) со 100 – кратным увеличением.

Анализ методом дифференциальной сканирующей калориметрии(ДСК) проводили на дифференциальном адиабатическом сканирующем микрокалориметре "ДАСМ-4" ("Биоприбор", Россия). Измерения проводили при скорости нагрева 1,0оС/мин в диапазоне температур от 20 до 100оС при избыточном давлении 2 атм.

Регистрацию спектров кругового дихроизма проводили на дихрографе MARK V “Jobin Ivon” (Франция), управляемом компьютером IBM-PS 1-6, в кювете с длиной оптического пути 1 см. Данные обрабатывали с использованием программы RDA.

Определение коэффициента седиментации. Седиментационный анализ проводили на аналитической ультрацентрифуге Beckman E с использованием фотоэлектрической сканирующей приставки.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

РАЗОБЩЕНИЕ ГЛИКОЛИЗА ПРИ ИНДУКЦИИ АЦИЛФОСФАТАЗНОЙ АКТИВНОСТИ ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-3-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

Одной из основных целей работы являлась проверка гипотезы, согласно которой, появление ацилфосфатазной активности у частично окисленной перекисью водорода глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГАФД), может приводить к разобщению окисления и фосфорилирования в гликолизе (Schmalhausen, Muronetz, 1997). Для проверки этого предположения мы изучили влияние Н2О2 на гликолиз, используя смесь очищенных ферментов гликолиза или цитоплазматическую фракцию из мышц крысы. Было показано, что окисление ГАФД Н2О2 действительно приводит к ускорению гликолиза на участке 3-ФГА – лактат как в смеси ферментов (рис. 1), так и в цитоплазматической фракции мышц.

Рис. 1. Зависимость накопления лактата от концентрации H2O2 при инкубации смеси ферментов в присутствии 3-ФГА и ADP. Концентрация 3-ФГА в среде 3мМ, концентрация ADP 1мМ. Накопление лактата в пробах, содержащих МЭ, принимали за 100% активности.

Концентрация перекиси водорода, вызывающая максимальный прирост лактата (на 100-150 %), в смеси ферментов и в мышечном экстракте составляет 5-10 и 100 мкМ, соответственно. Дальнейшее увеличение концентрации перекиси водорода приводит к снижению концентрации лактата в пробах, что объясняется ингибированием как дегидрогеназной, так и ацилфосфатазной активностей вследствие окисления Cys-149 до более высокой степени окисления, чем сульфеновая кислота.

Известно, что в аэробных условиях, при интенсивном функционировании митохондрий, протекание гликолиза должно затормозиться из-за недостатка ADP.

Мы предположили, что может произойти не замедление, а блокирование гликолиза из-за особенности сопряженной реакции, катализируемой ГАФД и 3-ФГкиназой. Так, после образования 1,3-ДФГ он может или связываться с 3-ФГкиназой или ацилировать ГАФД. В обоих случаях промежуточный комплекс является стабильным, причем превращения 1,3-ДФГ в 3-ФГ без добавления ADP не происходит. Окисление ГАФД может вызывать увеличение скорости гликолиза, за счет расщепления 1,3-дифосфоглицерата до 3-фосфоглицерата даже при очень низких концентрациях цитоплазматической ADP. При этом стадия, на которой происходит синтез АТP, исключается (и, следовательно, нет необходимости в использовании ADP), а реакция образования NADH становится независимой от киназной реакции и присутствия ADP.

Было показано, что в присутствии окисленной ГАФД гликолиз эффективно протекает даже при низких концентрациях ADP (Рис.2). Наибольшая разница в накоплении лактата между опытными пробами, содержащими 10 мкМ H2O2 и контрольными, содержащими 2 мм МЭ, наблюдается при низких концентрациях ADP (менее 0,5 мМ), когда скорость 3-ФГкиназной реакции падает из-за недостатка ADP. В этом случае наличие дополнительного ADP- независимого пути расщепления 1,3-ДФГ приводит к ускорению гликолиза. Сходные результаты были получены в эксперименте с цитоплазматической фракцией мышц.

Рис. 2. Зависимость накопления лактата от концентрации ADP при инкубации смеси ферментов в присутствии 3-ФГА. Концентрация H2O2 в опыте 10 мкМ, концентрация 3-ФГА 3 мМ, концентрации ADP указаны на рисунке, светлые столбики - пробы, содержащие H2O2; темные столбики - пробы, содержащие МЭ.


загрузка...