Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа: роль в регуляции энергетического обмена, индукции апоптоза и агрегации белков (19.01.2009)

Автор: Плетень Анатолий Петрович

ПЛЕТЕНЬ АНАТОЛИЙ ПЕТРОВИЧ

ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-3-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗА: РОЛЬ В РЕГУЛЯЦИИ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО ОБМЕНА, ИНДУКЦИИ АПОПТОЗА И АГРЕГАЦИИ БЕЛКОВ

03.00.04-Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва-2008

Работа выполнена в НИИ физико-химической биологии

им. А.Н.Белозерского Московского государственного университета

им. М.В.Ломоносова

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор

Муронец Владимир Израилевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ

Гильмиярова Фрида Насыровна

доктор биологических наук Гмошинский Иван Всеволодович

доктор биологических наук Калита Наталия Федоровна

Ведущая организация: Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской академии наук

Защита состоится «16» марта 2009 г. в 14 ч. на заседании Диссертационного совета Д.001.002.01 при ГУ НИИ питания РАМН (109240, г. Москва, Устьинский проезд, д. 2/14).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ питания РАМН.

Автореферат разослан «____»_____________ г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор Коденцова В.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Открытия последних лет показали, что хорошо известные биомолекулы могут участвовать в происходящих в клетке и организме процессах, проявляя новые, необычные функции. Полифункциональность, казалось бы, хорошо исследованных молекул биополимеров заставляет иначе взглянуть на их роль и значение [Ishitani et al., 1998, Муронец и др., 1999, Наградова, 2003]. Ярким примером такого полифункционального белка является глицеральдегид–3–фосфатдегидрогеназа (ГАФД) (NAD – зависимая фосфорилирующая D-глицеральдегид–3–фосфатдегидрогеназа, КФ 1.2.1.12), которая стала основным объектом данной работы.

ГАФД катализирует один из ключевых этапов гликолиза: реакцию окислительного фосфорилирования глицеральдегид–3–фосфата в 1,3–дифосфоглицерат с образованием NADH и является одним из самых изучаемых на сегодняшний день ферментов гликолиза [Наградова, 2001, Chuang et al., 2005]. Это связано не только с важностью обеспечиваемой им гликолитической функции, но еще и с обнаруженными многочисленными негликолитическими свойствами фермента в клетке [Tatton, 2000, Tisdale 2001]. Содержание ГАФД в тканях составляет 10-20% от общего количества растворимых белков, что свидетельствует об очень важной ее роли в жизни клетки. Наиболее необычным свойством ГАФД является ее способность превращаться при окислении сульфгидрильных групп в ацилфосфатазу, то есть приобретать новую ферментативную активность [Allison, Connors, 1970, Schmalhausen, Muronetz, 1997]. Функциональное значение появления такой активности ГАФД в регуляции энергетического обмена до сих пор было мало изучено. Кроме того, недавно было обнаружено, что ГАФД участвует в слиянии клеточных мембран и клеточной адгезии, экспорте тРНК, репликации и репарации ДНК. Имеются многочисленные данные о том, что ГАФД вовлечена в развитие нейродегенеративных заболеваний (болезни Альцгеймера и Паркинсона и др.) и вирусных инфекций, а также показано, что она играет важную роль в индукции апоптоза клетки [Sirover, 1999, Mazzola, Sirover, 2001]. Однако конкретные механизмы, объясняющие участие ГАФД во всех этих патологических процессах, до сих пор неизвестны. Было высказано несколько гипотез об участии ГАФД в регуляции важных для клетки процессов (в том числе, связанных с патологическими изменениями) [Schmalhausen, Muronetz, 1997, Arutyunova et, al., 2003, Polyakova et al., 2005, Hara et al., 2006], которые, однако, не получили пока достаточного экспериментального подтверждения в имеющейся научной литературе по данному вопросу.

Кроме того, учитывая важность ГАФД для функционирования клетки, особое значение приобретает разработка подходов, позволяющих избирательно воздействовать на ее свойства.

Цели и задачи исследования. Целью работы является определение характеристик и установление механизмов тех внутриклеточных процессов, в которых ГАФД участвует за счет проявления своих неканонических функций, несвязанных непосредственно с гликолитическим процессом.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Проверка гипотезы, согласно которой, появление ацилфосфатазной активности у частично окисленной перекисью водорода ГАФД, может приводить к разобщению окисления и фосфорилирования в гликолизе.

2. Проверка предположения, согласно которому изменение связывания окисленной ГАФД с нуклеиновыми кислотами является одним из механизмов вовлечения фермента в индукцию апоптоза, и изучение влияния изменения внутриклеточной локализации ГАФД при индукции апоптоза в клетках HeLa.

3. Изучение взаимодействия шаперонина с ненативными и неправильно свернутыми формами фермента (на примере ГАФД), а также влияния такого взаимодействия на шаперонин-зависимое сворачивание белков.

4. Разработка методов получения антител к различным формам ГАФД для создания высокоспецифических ингибиторов ферментов, функционирующих за счет белок-белковых взаимодействий.

Научная новизна работы. В настоящей работе была экспериментально подтверждена гипотеза о существовании разобщения окисления и фосфорилирования в гликолизе на стадии, катализируемой ГАФД и 3-фосфоглицераткиназой. Было доказано, что как в смеси ферментов гликолиза, так и в тканевых экстрактах окисление ГАФД приводит к ускорению гликолиза и, одновременно, к уменьшению синтеза ATP. Был установлен механизм обнаруженного явления. Оказалось, что мягкое окисление ГАФД перекисью водорода приводит к появлению у фермента ацилфосфатазной активности при сохранении дегидрогеназной. Это ведет к разобщению гликолиза, изменяя его энергетическую эффективность и скорость. Важнейшим результатом окисления ГАФД перекисью водорода является способность эффективно образовывать лактат при недостатке ADP как в смеси гликолитических ферментов, так и в цитоплазматической фракции мышц.

Были получены прямые доказательства предположения об изменении связывания окисленной ГАФД с нуклеиновыми кислотами как одного из механизмов вовлечения фермента в индукцию апоптоза и перераспределения фермента между внутриклеточными фракциями. Так было доказано, что окисление ГАФД увеличивает ее сродство к нуклеиновым кислотам, особенно в присутствии окисленного кофактора фермента - NAD. Впервые было показано, что такой модификацией является окисление цистеиновых остатков в активных центрах фермента. Эти данные впервые показывают важную роль модификации высоко реакционноспособных сульфгидрильных групп ГАФД в регуляции сродства фермента к нуклеиновым кислотам. Было впервые обнаружено, что при апоптозе, вызванном действием перекиси водорода, происходит перераспределение ненативных форм ГАФД между ядром и цитоплазмой.

Впервые было показано, что формы белков, неспособные в принципе свернуться в нативную конформацию, необратимо блокируют шаперонин, препятствуя тем самым правильному сворачиванию других полипептидных цепей. Так, было обнаружено, что инкубация шаперонина GroEL с мутантными O-R–димерами (или с ГАФДДТНБ) в растворе приводит к образованию стабильного комплекса. При этом связывание шаперонина с этими формами ГАФД блокирует GroEL-зависимый рефолдинг термостабильной ГАФД B.st.. Кроме того, впервые было обнаружено, что присутствие окисленных форм ГАФД также блокирует шаперон-зависимую стадию ренатурации.

Был предложен метод получения антител против неактивных форм ферментов, которые были способны вызывать инактивацию нативного фермента за счет индукции конформационных перестроек. Было доказано, что в определенных условиях инактивируются не только те субъединицы фермента, которые взаимодействуют с антителом, но и соседние (благодаря передаче белок-белковых взаимодействий между отдельными субъединицами). Этот подход открывает новые возможности создания специфических ингибиторов ферментов на основе антител, вызывающих конформационные перестройки в белках за счет неполного соответствия эпитопов и активных центров антител.

Практическое значение работы. На основании исследованных механизмов вовлечения ГАФД в регуляцию жизнедеятельности клетки в норме и патологии показано, что этот фермент является важным объектом для действия лекарственных препаратов. Прежде всего, возникает обоснованная возможность ускорять эффективность энергетического обмена путем ингибирования дегидрогеназной активности ГАФД мягкими окислителями. В этом случае окисленная ГАФД проявляет ацилфосфатазную активность, что приводит к разобщению окисления и фосфорилирования в гликолизе. В результате скорость гликолиза увеличивается, а снижение его эффективности (уменьшение образования АТР) компенсируется за счет окислительного фосфорилирования в митохондриях. Таким образом, нами предлагается новый способ воздействия на энергетический обмен клеток.

Обнаруженное нами влияние окисления ГАФД на эффективность ее связывания с нуклеиновыми кислотами и транслокацию в ядро позволяет, с одной стороны, предложить новые пути регуляции апоптоза, а с другой, разработать новые методы ранней диагностики патологических изменений в клетках и тканях на основе транслокации ГАФД из цитоплазмы в ядро.


загрузка...