Механизмы регуляции кардиоваскулярной стресс-реактивности и их вклад в развитие артериальной гипертензии (17.10.2011)

Автор: Семячкина-Глушковская Оксана Валерьевна

4. Определить роль вегетативных механизмов в регуляции ССС в норме, при стрессе и в условиях развития АГ, изучив гемодинамические показатели у нормотензивных и гипертензивных крыс при фармакологической модуляции холинергических и адренергических влияний на ССС.

5. Исследовать вклад эндотелиальных механизмов в регуляцию кардиоваскулярной стресс-реактивности и устойчивости к развитию АГ, изучив сосудистую чувствительность к ацетилхолину и активность системы генерации NO у нормотензивных и гипертензивных крыс в покое и при стрессе.

6. Изучить влияние дефицита мужских половых гормонов на механизмы регуляции ССС при различных физиологических состояниях организма (норма, стресс, артериальная гипертензия).

7. Проанализировать изменения в онтогенезе структуры кардиоваскулярной стресс-реактивности и устойчивости к развитию АГ, а также изучить механизмы, лежащие в основе этих процессов.

Научная новизна. Впервые в опытах на крысах проведено системное исследование механизмов регуляции кардиоваскулярной стресс-реактивности и устойчивости к развитию АГ. Полученные результаты свидетельствуют о том, что при различных физиологических состояниях организма - в условиях тяжелого стресса, при развитии различных форм АГ, в критические периоды созревания ССС на ранних этапах онтогенеза, в процессе старения организма отмечаются однотипные изменения в ССС в виде повышения сосудистых и/или хронотропных эффектов стресса. Эти данные позволяют заключить, что структура кардиоваскулярной стресс-реактивности является индикатором резервных возможностей ССС. При изучении роли стресса в развитии АГ впервые показано, что формирование и прогрессирование болезни обеспечивается разными механизмами. Начальные стадии АГ сопровождаются повышением сосудистых без изменения хронотропных эффектов стресса, что связано со снижением механизмов адренозависимой вазорелаксации без изменения адренозависимой вазоконстрикции. Прогрессирование АГ характеризуется высокой как сосудистой, так и миокардиальной чувствительностью к стрессу, что сопряжено с усугублением первичных нарушений в механизмах адренозависимой вазорелаксации и повышением прессорных и хронотропных эффектов адренергических влияний, опосредуемых через усиление активности холинергической системы в мозге. Впервые выявлены механизмы повреждения адренозависимой вазорелаксации на разных этапах развития АГ. На начальной стадии АГ данный процесс обеспечивается снижением активности КАТФ-каналов, на поздних - прогрессированием первичных нарушений в деятельности КАТФ-каналов и сопутствующим подавлением продукции NO. Получены оригинальные данные о том, что NO оказывает лимитирующие эффекты по отношению к интенсивности прессорных реакций при стрессе. При этомподавление продукции NO способствует повышению сосудистой стресс-реактивности и снижению устойчивости к развитию АГ. Впервые в опытах с кастрацией было выявлено, что кардиоваскулярные эффекты андрогенов зависят от физиологического состояния организма. В условиях нормы андрогены стимулируют КАТФ-зависимые неэндотелиальные механизмы вазорелаксации, но при этом не оказывают влияний на базальную и стрессорную активность ССС. При развитии АГ на фоне гипотестостеронемии указанные вазорелаксирующие эффекты андрогенов снижаются, что сопровождается подавлением эндотелиальных механизмов вазорелексации, опосредованных через стимуляцию К+-каналов, и повышением сосудистой стресс-реактивности, способствующей снижению устойчивости к развитию АГ. Новыми являются данные о возрастных особенностях устойчивости к развитию АГ, опосредованных через изменения в онтогенезе кардиоваскулярной стресс-реактивности, адренергических и NO-зависимых механизмов ее регуляции.

Научно-практическая значимость работы. Результаты исследований механизмов регуляции кардиоваскулярной стресс-реактивности в норме и при развитии АГ являются актуальными и важными не только для фундаментальной физиологии, но и для прикладной медицины, позволяя существенно продвинуться не только в понимании роли стресса в развитии данного заболевания, но и повысить эффективность профилактики, диагностики и лечения АГ. Полученные данные о том, что длительные сосудистые эффекты стресса являются индикатором формирования АГ вне зависимости от ее этиологии, свидетельствуют о перспективности использования указанной характеристики стресс-реактивности ССС в качестве прогностического критерия риска развития АГ у людей. Установлено, что снижение активности ?2-адренергических механизмов вазорелаксации является ключевым звеном в повышении сосудистой стресс-реактивности и развитии АГ. При этом показано, что латентная стадия АГ характеризуется подавлением КАТФ-зависимых механизмов адренергической вазорелаксации, устойчивая АГ - прогрессирующим снижением функции КАТФ-каналов и подавлением секреции NO. Эти данные дают основание для рекомендации дифференцированной коррекции активности ?2-адренозависимых механизмов вазодилатации у лиц с признаками транзиторной и устойчивой АГ. Результаты исследования механизмов васкулярных эффектов андрогенов и их тесной зависимости от физиологического состояния организма существенно расширяют научные представления о роли мужских половых гормонов в регуляции ССС и их вкладе в развитие АГ. Выявленное нами снижение секреции тестостерона при развитии АГ представляет практический интерес для эндокринологов и сексопатологов при лечении гипертензивных пациентов. Показано, что NO повышает устойчивость к АГ в значительной степени за счет его лимитирующих эффектов по отношению к интенсивности сосудистого компонента стресса, что позволяет рекомендовать использование доноров NO в качестве профилактического средства в группе риска развития АГ. Данные по механизмам онтогенетических особенностей формирования АГ имеют несомненную ценность при коррекции АД у гипертензивных пациентов в различных возрастных группах.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на ежегодных европейских конгрессах по АГ (Италия, Милан 2003, 2007, 2011 гг.; Испания, Мадрид, 2006 г.; Норвегия, Осло, 2010 г.); на ежегодных турецких конгрессах по АГ и атеросклерозу (Турция, Измир, 2008; Анталья, 2009; Кабардокия, 2010 г); на международных конференциях по защите здоровья (Мумбай, Индия, 2009 г.) и нейрофизиологии (Германия, Марбург, 2009 г; Дрезден, 2009 г.), на российской конференции по актуальным вопросам медицины (Россия, Астрахань, 2008 г.) и ежегодном конгрессе кардиологов (Москва, 2009, 2010 гг.). Материалы диссертации докладывались и обсуждались на открытом заседании кафедры физиологии человека и животных федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования “Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского”.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 50 научных работ, в том числе рекомендованных ВАК РФ - 16, 1 монография, 2 патента РФ на изобретения.

Декларация личного участия автора. Экспериментальные исследования выполнялись автором лично, либо при его непосредственном участии в коллективных работах (Государственные контракты NK-144P от 31.07.2009 г., NK-1257P от 1.08.2009 г., NK-1063P от 30.05.2010 г. на “проведение исследований научными группами под руководством докторов/кандидатов наук”, мероприятия 1.1./1.2 “Проведение научных исследований научными группами под руководством докторов наук и кандидатов наук”, направления 1 “Стимулирование закрепления молодежи в сфере науки, образования и высоких технологий” федеральной целевой программы “Научные и научно-педагогические кадры инновационной России” на 2009-2013 годы). В совместных публикациях вклад автора составил 50-90%.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследований и выводов. Общий объем диссертации 292 страницы с 78 рисунками и 3 таблицами. Список цитированной литературы включает 638 источников, в том числе 82 отечественных и 556 иностранных.

Положения, выносимые на защиту.

1. Кардиоваскулярная стресс-реактивность является индикатором резервных возможностей ССС, однотипно изменяясь в виде повышения сосудистых и/или хронотропных эффектов стресса при повреждениях ССС в условиях тяжелого стресса, при развитии различных форм АГ, в критические периоды созревания ССС на ранних этапах онтогенеза, в процессе старения организма.

2. Увеличение продолжительности сосудистых эффектов стресса отражает нарушения кардиоваскулярного фенотипа и является прогностическим критерием риска развития АГ вне зависимости от ее этиологии.

3. В основе увеличения длительности прессорных эффектов стресса при развитии АГ лежит снижение активности ?2-адренергических механизмов вазорелаксации, опосредованное на начальной стадии АГ снижением активности КАТФ-каналов, на поздней - прогрессированием первичных нарушений в деятельности КАТФ-каналов и сопутствующим подавлением продукции NO.

4. Оксид азота оказывает лимитирующие эффекты в отношении интенсивности прессорных реакций при стрессе, повышая таким образом устойчивость к развитию АГ.

5. Кардиоваскулярные эффекты андрогенов определяются исходным состоянием организма. В норме андрогены не играют принципиальной роли в регуляции ССС ни в покое, ни при стрессе. При АГ снижение уровня андрогенов приводит к повышению сосудистой стресс-реактивности и потенциированию развития данного заболевания за счет снижения их стимулирующих эффектов по отношению к К+-зависимым неэндотелиальным (КАТФ-каналы) и эндотелиальным (EDHF) механизмам вазорелаксации.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены на 1320 самцах белых беспородных крыс. Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с принципами Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным.

Регистрацию гемодинамических параметров - среднего артериального давления (ср.АД) и частоты сердечных сокращений (ЧСС) у бодрствующих крыс осуществляли на компьютерно-вычислительном комплексе для прямой регистрации кровяного давления у мелких животных (PowerLab/400 ML 401, ID Instruments, 2002, Австралия) с программным обеспечением Chart 4, оснащенным датчиками кровяного давления (MLT0699, PowerLab, ID Instruments). С этой целью за сутки до экспериментов животным вживлялся полиэтиленовый катетер (ClayAdams, Parsippany, NewYersey) в аорту через левую ветвь сонной артерии под общей нембуталовой анестезией (Sigma, 0.40 мг/кг, ip) (Dworkin, 1980; Fejes-TothG., 1984; Мурашев, 1992). Для постоперационного восстановления животные помещались в индивидуальные клетки (0.3Ѕ0.25Ѕ0.2 м). Эксперименты проводили спустя 24 часа после операции. Перед началом каждого опыта крысы адаптировались к экспериментальной обстановке в течение 30 мин. В этот период испытуемому животному через катетер вводили раствор гепарина для предотвращения тромбообразования на его стенках (Biochemi, Austria 25000 ED/5ml, из расчета 1000 ED/0.2 мл гепарина в 0.8 мл физиологического раствора в объеме 0,2 мл раствора гепарина).

С целью проведения фармакологических тестов животным под общей нембуталовой анестезией имплантировали полиэтиленовый катетер в верхнюю полую вену через наружную яремную вену. Объемные дозы препаратов измеряли с помощью гамильтонов. Объем вводимых препаратов составлял 100 мкл/100 г веса животного.

Для изучения активности периферических адренорецепторов применялись следующие препараты: фенилэфрин (Харьков, Украина, 2,5 мкг/кг, iv) - для стимуляции ?1-адренорецепторов, тирамин (Лонгви Фарм, Россия 10 мг/кг, iv) - для стимуляции выброса нейромедиатора из синаптических везикул в адренергических нейронах, пропранолол (ISIS Pharma GmbH, 0,1 мг/100 кг, iv) - для блокады ?-адренорецепторов, изопротеренол (Sigma, 0,0005; 0,005; 0,05 мкг/кг, iv) - для стимуляции ?2-адренорецепторов, йохимбин (Solvay Pharma, Германия, 0,15мг/кг, iv) - для блокады ?2-пресинаптических адренорецепторов. Для изучения активности эндотелиальных факторов использовали: ацетилхолина хлорид (Pharma, Чехия, 0,3 мкг/кг, iv) - для стимуляции эндотелий-зависимой вазорелаксации, NG-nitro-L-arginine-methylester (Sigma, L-NAМЕ, 2,5; 5; 10 мг/кг, iv) - для блокады NO-синтазы, индометацин (Sopharma, Болгария, 2,5; 5; 10 мг/кг, iv) - для блокады синтеза простациклина (PGI2). Блокада холинергических влияний на ССС осуществлялась путем введения атропина сульфата (Воронеж, Россия, 0,2мг/100г, iv). Для блокады КАТФ-каналов использовали глибенкламид (АЛСИ, Россия, 2,5; 5; 10 мг/кг, iv).

Моделирование ренальной артериальной гипертензии осуществляли путем создания с помощью определенных хирургических манипуляций искусственного стеноза главной ренальной артерии (Семячкина-Глушковская, 2007).

С целью изучения влияния стресса на устойчивость к развитию ренальной АГ клипсированные животные спустя 3 дня после операции на протяжении 7 недель подвергались ежедневному стрессу в виде иммобилизации на спине в течение 10 мин.

Моделирование стресс-индуцированной артериальной гипертензии достигалось путем содержания крыс в течение 4 месяцев в условиях социального стресса - перенаселение или изоляция (Семячкина-Глушковская, 2009).

С целью изучения резервных возможностей ССС изучали кардиоваскулярную стресс-реактивность в условиях тяжелого стресса, провоцирующего развитие церебро- и кардиоваскулярных повреждений (Анищенко, 1992; 1995). Моделирование тяжелого стресса, представляющего собой комбинированное воздействие иммобилизации и прерывистого звука 100 дБ в течение 120 мин, осуществляли по методу Т.П. Романовой (1989; 1990). Контролем в данной серии эксперимента служили крысы, подвергнутые физиологическому стрессу - иммобилизации животных на спине в течение 2-х часов.

Определение оксида азота в крови. Содержание NO определяли по наличию нитритов в крови с применением реактива Грисса с использованием спектрофотометра (СФ-46, 2002, Санкт-Петербург) при длине волны 538 нм (Карпюк, 2000).

Определение тестостерона в крови проводили иммуноферментным методом (Wilson, 1992) с использованием компьютерно-диагностического комплекса IMMULITE 2000 (США) на базе диагностического центра г. Саратова “ДиЦентр”.

Опыты по изучению онтогенетической динамики кардиоваскулярной устойчивости к стрессу и развитию АГ проводились на инфантальных животных массой 50-70 гр. (6 недельный возраст), половозрелых особях 220-270 гр. (5-7 месячный возраст) и стареющих крысах массой 340-380 гр. (24-30 месячный возраст).

С целью изучения роли половых гормонов в регуляции базального и стрессорного уровней АД проводили гонадэктомию нормотензивных и гипертензивных самцов в соответствии со стандартной методикой кастрации (Коган, 1980).

Статистическая обработка экспериментальных данных осуществлялась с помощью пакета программ Statistica 5.0. Различия считались достоверными при р<0.05. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Роль стресса в развитии артериальной гипертензии

В исследованиях по моделированию развития АГ с использованием длительных социальных стрессов (перенаселение или изоляция) была доказана инициирующая роль стресса в генезе АГ у крыс. Исследования проводились на 4 группах животных: в первой группе ср.АД и ЧСС регистрировались через 1 месяц, во второй - через 2 месяца, в третьей - через 3 месяца и в четвертой - через 4 месяца после помещения крыс в условия социальной депривации или перенаселения. Число животных в группах распределилось следующим образом. Для крыс, проживающих в одиночестве: 1-ая группа (n=12), 2-ая группа (n=11), 3-ая группа (n=11), 4-ая группа (n=18). Для животных, находящихся в условиях перенаселения: 1-ая группа (n=10), 2-ая группа (n=10), 3-ая группа (n=12), 4-ая группа (n=14). Контрольную группу (n=10) составляли здоровые животные, не подвергавшиеся стрессу. Через один месяц исследования у крыс, проживающих в условиях как социальной депривации, так и повышенной популяционной плотности, не были выявлены какие-либо изменения в показаниях ср.АД и ЧСС по сравнению с контролем (104±2 мм рт.ст. и 101±2 мм рт.ст. против 98±2 мм рт.ст.; 352±8 уд/мин и 360±12 уд/мин против 362±11 уд/мин, соответственно). Через 2 месяца наблюдения у 4-х из 11 изолированных крыс и у 3-х животных из 10, проживающих в условиях высокой популяционой плотности, отмечалось достоверное повышение уровня ср.АД 132±3 мм рт.ст., p<0.05 и 127±2 мм рт.ст., p<0.05 против 98±2 мм рт.ст., что составило 134±3%, p<0.05 и 129±2%, p<0.05, соответственно). На данном этапе исследований ЧСС не изменялась в обеих экспериментальных группах. Через 3 месяца проведения экспериментов наблюдалось дальнейшее увеличение числа крыс с высокими показателями ср.АД (138±2 мм рт.ст., p<0.05 и 132±4 мм рт.ст., p<0.05 против 98±2 мм рт.ст., что составило 140±5%, p<0.05 и 134±2%, p<0.05, соответственно). Гипертензивные значения ср.АД регистрировались более, чем у половины животных в обеих экспериментальных группах (7 из 11 крыс - изоляция и 7 из 12 крыс - перенаселение). Через 3 месяца наблюдения у части крыс (2 случая из 7 как в группе с изоляцией, так и с перенаселением) с высокими показателями ср.АД отмечалось достоверное повышение уровня ЧСС (409±7 уд/мин, p<0.05 и 415±9 уд/мин, p<0.05 против 362±11 уд/мин, соответственно).

Наиболее яркие результаты были получены через 4 месяца пребывания животных в условиях социального стресса. У большинства крыс регистрировались высокие значения ср.АД (16 из 18 крыс - изоляция и 11 из 14 крыс - перенаселение). У 10 из 16 крыс с высокими значениями ср.АД в группе с изоляцией и у 6 из 11 крыс в группе с перенаселением отмечалась тахикардия. Повышение уровня ср.АД отмечалось до 165±1 мм рт.ст. (p<0.05) в группе с изоляцией и до 141±2 мм рт.ст. (p<0.05) в группе с перенаселением, что составило 168±4% (p<0.05) и 143±4% (p<0.05) от контроля, соответственно. Значения ЧСС достигали 447±12 уд/мин в группе с изоляцией и 436±12 уд/мин в группе с перенаселением, что составило от контроля 123±5% (p<0.05) и 120±4% (p<0.05), соответственно.

Через 4 месяца наблюдения у всех животных с высоким уровнем АД и ЧСС отмечалось снижение их двигательной активности, повышение агрессивности и ухудшение структуры волосяного покрова, а также увеличение массы надпочечников (17±0,5 мг/100г, p<0.05 и 15±0,7 мг/100г, p<0.05 против 12±0.9 мг/100г в группах с изоляцией и перенаселением, соответственно), что является прямым отражением наличия у животных стресса, развившегося в результате их проживания в условиях одиночества или высокой численной плотности.

Для подтверждения гипертензивного статуса у крыс с высоким уровнем ср.АД и ЧСС через 2 недели после отмены 4-х месячного стресса у части животных (10 из группы изоляции и 7 из группы перенаселения) производилась повторная регистрация указанных параметров гемодинамики. У всех исследуемых крыс отмечались устойчиво высокие показатели ср.АД и ЧСС по сравнению с контролем (159±2 мм рт.ст., p<0.05 в группе с изоляцией и 147 мм рт.ст., p<0.05 в группе с перенаселением против 98±2 мм рт.ст. в контроле), что подтверждает наличие сформировавшейся стресс-индуцированной АГ у животных.

Следует, однако, отметить, что на всех этапах исследования выявлялись особи, устойчивые к развитию АГ и даже через 4 месяца наблюдения у 2 из 18 крыс, проживающих в изоляции, и 3 из 11 животных, находящихся в условиях высокой популяционной плотности, не были зарегистрированы высокие уровни ср.АД и ЧСС (107±2 мм рт.ст.в группе с изоляцией и 104±4 мм рт.ст. в группе с перенаселением против 98±2 мм рт.ст. в контроле). Эти результаты свидетельствуют об индивидуальных особенностях механизмов устойчивости к развитию стресс-индуцированной АГ.

Таким образом, результаты, представленные в данной серии экспериментов, свидетельствуют о том, что хронический психоэмоциональный стресс выполняет пусковую роль в формировании АГ.

Не менее актуальным является вопрос - какую роль играют кратковременные “легкие” эмоциональные стрессы, являющиеся ежедневными спутниками современного человека, в формировании АГ? В данной серии экспериментов изучалось влияние ежедневного эмоционального стресса (10-мин иммобилизация) на протяжении всего срока (в течение 7 недель) формирования АГ у крыс с экспериментальной ишемией почки. В генезе развития ренальной модели АГ выделяют 3 стадии - 1-3 недели (латентная АГ); 4-5 недель (средней тяжести АГ); 7 недель (устойчивая АГ) (Goldblett, 1934; Sigmon, 1998). В соответствии с критическими периодами формирования АГ животные были разделены на 3 группы. В первой группе (n=10) гемодинамические параметры, а также масса сердца и почек измерялись через 1 неделю, во второй (n=15) - через 4 недели, в третьей (n=15) - через7 недель после наложения клипсы. Контролем служили ложнооперированные крысы (n=10).

В контрольной группе ср.АД составляло 102±2 мм рт.ст., ЧСС - 340±8 уд/мин, масса сердца - 870±7 мг, масса левой почки - 1510±16 мг. Через 1 неделю после операции у клипсированных крыс не отмечалось изменений в показателях ср.АД, ЧСС, а также в массе сердца и ишемизированной почки. Через 4 недели после наложения клипсы у 10 из 15 животных наблюдалось повышение уровня ср.АД до 120±3 мм рт.ст. (p<0.05), что составило 117±2% (p<0.05) от контроля. Изменения со стороны ЧСС в виде тахикардии проявлялись лишь у 2 крыс из 10 с высоким ср.АД, у которых пульс достигал 387 уд/мин и 398 уд/мин, что составило 114±3% и 117±2% от базальных значений. Масса сердца увеличивалась на 15% (p<0.05) у всех гипертензивных животных вне зависимости от изменения пульса. Масса ишемизированной почки уменьшалась в 3,7 раза (p<0.05) также у всех гипертензивных крыс. Через 7 недель после операции у подавляющего числа крыс (12 из 15) наблюдались достоверно высокие показатели ср.АД - 141±3 мм рт.ст. (p<0.05), что составило 138±4% (p<0.05) от контроля. У 10 из 12 гипертензивных животных отмечался высокий пульс, который достигал 410±11 уд/мин (p<0.05), что составило 120±5% (p<0.05) от базальных значений. Масса сердца была увеличена на 26% (p<0.05) у всех крыс с высокими показателями ср.АД. Масса ишемизированной почки уменьшалась в 9,8 раза (p<0.05) у всех гипертензивных самцов.


загрузка...